实验一细胞器的活体染色与观察线粒体活体染色与观察实验目的1．掌握细胞器活体荧光标记技术。

2．观察和了解活细胞内线粒体的形态、结构与分布特点。

实验原理对细胞的结构及功能的研究历来是细胞生物学的主要内容。

活体染色是指使生活有机体的细胞或组织着色但对其又无毒害作用的一种染色方法。

它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。

体内活染是将胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，使这些特殊结构易于被识别。

体外活染又称超活染色，它是将活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，用染料溶液浸染，染料被选择性地固定在活细胞的某种结构上而显色。

随着细胞生物学的实验研究技术发展，对细胞的研究正经历着从简单到复杂，从静态到动态，从单维度到多维度的发展。

其中，细胞器的活体荧光标记技术是现代细胞生物学研究常用的重要实验技术。

这种技术可以从分子水平上动态地研究活细胞中的各种生理活动，极大地增强了人们对细胞的认识能力。

这种技术能够用来分析细胞的信号转导、物质运输、能量代谢和膜电位的变化等。

现在，已经有许多细胞器特异的商业化荧光染料。

Golgi-Tracker Red是一种高尔基体红色荧光探针，可以用于活细胞高尔基体特异性荧光染色。

Golgi-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的BODIPY TR进行了荧光标记的C5-ceramide。

Golgi-Tracker Red可以用于活细胞的高尔基体荧光标记，但不适合用于固定细胞的标记。

Golgi-Tracker Red的最大激发光波长为589 nm，最大发射光波长为617 nm。

BODIPY-FL-神经酰胺是一种脂类物质，能特异地标记高尔基体。

BODIPY-FL-神经酰胺的最大激发光波长是464 nm，最大发射光波长为532 nm。

DiO-C6( 3)是一种短链碳酸化氰苷染料，可以标记包括内质网在内的多种膜性细胞器。

但是，根据形态、结构特征，内质网很容易被识别。

D10-C6(3)的最大激发光波长为484 nm，最大发射光波长为501 nm。

罗丹明123是一种阳离子荧光染料。

活体线粒体能够产生膜电位，可以吸引罗丹明123进入线粒体。

因此，罗丹明123能够特异地标记线粒体。

罗丹明123的最大激发光波长为504 nm，最大发射光波长为534 nm。

Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。

这种染料会结合到DNA的A-T富集区域，所以也常用于普通的细胞核染色或常规的DNA染色。

Hoechst 33258的最大激发光波长为346 nm，最大发射光波长为460 nm; Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发光波长为352 nm，最大发射光波长为461 nm。

詹纳斯绿B(Janus green B)可专一性地对线粒体进行活性染色，这是由于线粒体内细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色。

中性红( neutral red)对液泡和溶酶体的染色具有专一性，可将活细胞中的液泡和溶酶体染成红色。

中性红也可作为荧光染料来标记液泡和溶酶体，其最大激发光波长为541 nm，最大发射光波长为640 nm。

实验用品1．材料小白鼠肝细胞2．试剂( 1) Ringer液NaCl: 0.85%; KCI: 0.03%; CaCI2: 0.033%。

( 2) 0.02%詹纳斯绿B水溶液。

3．器材剪刀、镊子、解剖刀、眼科剪、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸。

实验程序1．线粒体的活体染色与光学显微镜观察（詹纳斯绿B染色法）（1）人口腔黏膜上皮细胞线粒体的活体染色与观察’1)取干净的载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴两滴0.02%詹纳斯绿B染液。

2)实验者用牙签在自己口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的黏液状物放人载玻片上的染液中，染色10-15 min（注意不可使染液干燥，必要时可再加染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置于光学显微镜下观察。

3)在低倍镜下，选择平展的口腔黏膜上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。

可见扁平状上皮细胞细胞核周围的胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体。

（2）小白鼠肝细胞线粒体的活体染色与观察1)用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放人表面皿内。

用吸管吸取Ringer液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。

2)在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加0.02%詹纳斯绿B染液，再将肝组织块移人染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上半部分露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分氧化，易被染色。

当组织块边缘被染成蓝绿色即可（一般需染20-30 min）。

3)吸去染液，滴加Ringer液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。

然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。

4)在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有1-2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。

(3)洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的活体染色与观察1)用吸管吸取0.020-/0詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上。

然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10-15 min。

2)用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。

3)在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处，仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。

‘实验二细胞的原代培养【实验目的】1．熟悉并掌握原代培养中取材、消化及无菌操作等基本实验技术。

2．了解细胞原代培养的原理及其方法。

【实验原理】原代培养( primary culture)是从供体取得组织或细胞后在体外进行的首次培养，是建立各种细胞系的第一步。

原代培养的细胞由于刚刚离体，生物学特性与在体细胞接近，故在各种细胞生物学实验中有广泛应用，较适合进行药物测试、细胞分化等实验。

原代培养的方法很多，最基本的方法有两种，即组织块法和消化法。

组织块法是最常用的原代培养方法，该方法利用刚刚离体的、有旺盛生长活力的组织作为实验材料，将其剪成小块接种在培养瓶中，大约24h后，细胞即可从贴壁的组织块四周游出并生长。

利用组织块法进行的原代培养，操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，在对一些来源有限、数量较少的组织进行原代培养时，选择该法尤为合适。

消化法是一种结合化学与生化手段进行的原代培养方法。

该方法的主要特点是利用消化试剂将较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质（基质、纤维等）加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接松散、相互分离，形成含单细胞或细胞团的悬液，因单细胞或细胞团易于从外界吸收养分和排出代谢产物，经体外适宜条件培养后，可以得到大量活细胞，在短时间内细胞即可生长成片。

酶是常用的消化试剂，在原代培养中，对于一些间质少、较软的组织，如上皮、肝、肾、胚胎等，选择胰蛋白酶来加以消化可收到较好的效果。

胶原酶因其对胶原有较强的消化作用，因此适合用在对纤维性组织、一些较硬的癌组织等的消化中。

本实验中将以胰蛋白酶为例，介绍原代培养的酶消化法。

【实验器材和试剂】【分组形式】2～3人一组。

【操作步骤】（一）组织块法（以新生太鼠肝细胞的原代培养为例）1．将新生大鼠全身用75%酒精棉球反复擦拭消毒。

2．将消毒后的大鼠移入超净工作台中，再用75%酒精消毒一次。

3．在培养皿中将大鼠处死（断头法），用眼科剪打开腹腔，取出肝组织，置于培养皿中。

4．用D-Hank液反复冲洗肝组织，以去除血细胞。

5．用眼科镊将肝组织块上所附的结缔组织尽可能去除，以避免杂细胞的污染。

6．将肝组织移入一新的培养皿中，用吸管吸取0. 5ml培养基置于肝组织上，用另一眼科剪将其剪成lrrirr13左右的小块。

7．用一弯头吸管小心地将剪碎的肝组织块吸人，放置于培养瓶底部。

8．并用弯头吸管头移动肝组织块，使其在培养瓶底部均匀分布，控制每小块间距在0. 5cm左右，25ml培养瓶放置15～20块。

9．吸取少量培养基，沿培养瓶颈缓缓滴入，培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。

10.轻轻将培养瓶置于培养箱中培养。

11. 24h后取出观察，即有少量细胞从组织块周围游离而出，视需要补以少量培养基。

（二）消化法（以胰蛋白酶消化为例）1．取新生大鼠的肝组织，用D-Hank液漂洗3次，用眼科剪、镊去除附着在肝组织上的结缔组织。

2．将肝组织剪成1~ 2mm 3左右的小块。

3．将肝组织块置入三角烧瓶内，放入磁力搅棒，再注入30～50倍组织量的预热到37℃的胰蛋白酶液。

4．将三角瓶放在磁力搅拌器上进行搅拌，速度要慢一些，消化时间控制在l0～20min。

也可将三角瓶放入水浴或温箱中，每隔5min摇动一次。

如需长时间消化，可每隔5min取出2/3上清液移入另一离心管冰浴或离心后去除胰蛋白酶加入含血清培养基，然后再给原三角烧瓶添加新的胰蛋白酶继续消化。

如果在4℃条件下进行冷消化，时间可长达12～24h。

从冰箱取出离心后，可再添加胰蛋白酶，放入37℃温箱中继续温热消化20～30min，效果可能更好。

5．在消化过程中，可随时吸取少量消化液在倒置显微镜下观察，当发现组织已分散成小的细胞团或单个细胞，可终止消化。

6．消化完毕后将消化液和分次收集的细胞悬液通过不锈钢网滤过，以除掉未消化充分的大块组织。

7—800～1 000rpm离心3～5min去除含胰蛋白酶的上清。

8．用D-Hank液漂洗1～2次，每次800～1 000rpm离心3～5min，去除上清。

9．加入含10%血清的DMEM培养基，吹打沉淀制悬。

10.进行细胞计数，一般按5×105～1×106的密度接种到培养瓶，于37℃条件下培养。

【观察与记录】1．组织块法培养细胞的观察培养24h后，倒置显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿游离出来；48h后，可见大量的细胞放射状排列于组织块周围，这些细胞胞核较大，胞质内含物少、透明度高，彼此间排列紧密。

靠近组织块的细胞胞体较小、较圆，离组织块较远的区域可见有多角形的细胞，体积较大，有些细胞的形态间于圆形与多角形之间。

2．胰蛋白酶消化法培养细胞的观察在倒置显微镜下，可见刚接种于培养瓶中的细胞胞体均成圆形，悬浮于培养液中。

24h后，大多数细胞已贴附于培养瓶底部，胞体伸展，重新呈现出其肝细胞原有的、不规则多角形上皮性细胞特征。

48h以后，细胞开始增殖，细胞的数量明显增多，在接种的细胞或细胞团的周围可见有新生的细胞，这些细胞胞体轮廓通常较浅，因内含物少而较为透明。