生化制备技术实验操作指导温州大学生命与环境科学学院2012年2月实验须知1．实验室规则(1) 实验课须遵守实验室开放时间，应自觉遵守课堂纪律，严禁在实验室吃东西、大声喧哗等行为。
每组成员可按个人时间协作完成实验过程，但必须每位成员都参与到实验当中，并由组长预先提交实验分工安排书，交予指导教师作为签到依据。
(2) 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约, 应特别注意保持药品和试剂的纯净, 严防混杂污染。
(3) 实验台、试剂药品架必须保持整洁, 仪器药品摆放井然有序。
实验完毕,需将药品、试剂排列整齐, 仪器洗净倒置放好, 实验台面抹拭干净, 经教师验收仪器后, 方可离开实验室。
实验仪器为配套使用，不可随意调换。
每组组长在实验进行之前及结束之后负责对仪器和耗材进行清点，及时反映问题。
(4) 使用和洗涤仪器时, 应小心谨慎, 防止损坏仪器。
使用精密仪器时, 应严格遵守操作规程, 发现故障应立即报告教师, 不要自己动手检修。
(5) 在实验过程中要听从教师的指导, 严肃认真地按操作规程进行实验, 并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。
课后写出实验报告, 实验课程完全结束后由学习委员收齐交给教师。
(6) 仪器损坏时, 应如实向教师报告, 认真填写损坏仪器登记表。
(7) 实验出现问题，不建议盲目重做，应及时总结原因，给出合理解释。
实验课不完全以最终实验结果为评分依据，更重要的是考察分析问题和解决问题的能力。
(8) 每次实验课安排同学轮流值日, 值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。
2．实验记录实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写在记录本上。
实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。
实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。
实验中观察到的现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。
原始记录必须准确、简练、清楚。
3．实验报告的书写实验结束后,应及时整理和总结实验结果, 写出实验报告。
(1)标题标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验组号、实验者及同组者姓名、实验室条件。
(2)实验目的(3)实验原理应简述基本原理，不要完全照抄实验指导书。
(4)操作步骤操作步骤(或方法)可以采用流程图的方式或自行设计的表格来表达。
(5)实验结果将实验中的现象、数据进行整理、分析，得出相应的结论。
建议尽量使用图表法来表示实验结果，这样可以使实验结果清楚明了。
(6)讨论包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的改进意见等。
4．生物化学实验课评分标准◆实验预习情况（20%）◆实验操作情况（20%）◆实验报告情况（20%）——亲和层析法纯化胰蛋白酶实验一鸡卵粘蛋白的提取【实验目的】掌握鸡卵粘蛋白的基本性质以及提取、分离和纯化的基本原理和方法；学习鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶抑制活性测定的基本技术【实验原理】鸡卵粘蛋白是由四个分子量相近的亚基组成的糖蛋白，相对分子量在28000 Da左右，糖基部分主要含有D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸，等电点在3.9-4.5之间。
鸡卵粘蛋白在鸡蛋清中含量丰富，并且与鸡卵清蛋白性质相比，具有较好的化学稳定性。
在80℃条件下,理化性质不发生改变；在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度；在10%的三氯乙酸的溶液中不发生沉淀；在pH3.0的溶液中稳定, 但在pH8.0的溶液中容易分解。
表1. 鸡卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度溶液pH 鸡卵粘蛋白鸡卵清蛋白= 3.5 沉淀5% 溶解95% 沉淀95% 溶解5%< 3.5 沉淀↑溶解↓沉淀↑溶解↓> 3.5 沉淀↓溶解↑沉淀↓溶解↑通过选择合适的pH值、三氯乙酸浓度和丙酮浓度，可以从鸡蛋清中获得鸡卵粘蛋白的粗体液。
如表1.所示，鸡卵粘蛋白和清蛋白在不同pH值的10%TCA溶液中具有不同的溶解状态。
由于鸡卵粘蛋白具有良好的稳定性，在pH3.5的10%三氯乙酸溶液中鸡卵粘蛋白能保持良好的溶解度，而与其共存的清蛋白绝大部分被沉淀出来，这样就可以初步将二者分开。
溶解在10%的三氯乙酸中的鸡卵粘蛋白通过丙酮沉淀而获得粗品，再经阴离子交换柱色谱进一步分离纯化就可获得较纯的鸡卵粘蛋白。
【器材与试剂】1.器材pH酸度计（pH试纸）、磁力搅拌器、圆环、玻璃漏斗、低速离心机、50 ml离心管、滤纸、真空干燥器、循环水式真空泵、储液罐、色谱柱(30×3 cm、20×3 cm)、抽滤瓶、胶塞、恒流蠕动泵、紫外检测仪、记录仪、自动部分收集器、铁架台、双拧丝、万能夹、透析袋、透析袋夹2.试剂（1）10%TCA溶液, pH1.15 (50ml/组)（2）0.05mol/L ,pH8.0 Tris-HCl缓冲液, (内含0.2%CaCl2) 200ml（3）2mmol/L BAEE底物溶液200ml（4）1mg/mL Trypsin标准溶液10ml（5）0.2mol, pH6.6, PBS缓冲液120ml (×10)（6）0.3mol/L NaCl –0.02 mol/L , pH6.6, PBS缓冲液100ml（7）0.5mol/L HCl溶液200ml（8）0.5mol/L NaCl –0.5mol/L NaOH溶液200ml（9）0.5mol/L NaCl 溶液250ml（10）Sephadex G-253.原料新鲜鸡蛋【实验步骤】4.鸡卵粘蛋白的提取（1）提取：取50毫升的鸡卵清放入250毫升烧杯中，边轻轻搅拌边缓缓加入等体积的10% TCA溶液（pH1.15），搅匀后用pH试纸检查pH值,待pH稳定在3.5±0.2后放置4℃冰箱过夜.（2）离心：将鸡卵粘蛋白提取液转移至50毫升离心杯中，平衡后于3000 rpm 离心15min。
收集上清液。
（3）过滤：将上清液用滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物。
（4）调pH值：在pH计上用1 mol/L HCl 将溶液精确调至pH 3.5。
量取体积。
（5）丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷的丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。
（6）离心：吸出上清部分，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000 rpm离心15 min。
（7）除残留丙酮：弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯至于真空干燥器中。
抽去残留丙酮。
（沉淀物的颜色由白变成透明胶状物即可）（8）溶解：加入25 ml蒸馏水或20 mmol/L，pH 6.5磷酸缓冲液溶解，滤纸过滤，收集滤液，备用。
5.鸡卵粘蛋白的分离纯化（1）Sephadex G-25 柱脱盐○1介质预处理：称取15g Sephad ex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。
将胶轻轻悬起，待其缓慢沉降后，弃去未能沉降的胶粒。
将胶移入抽滤瓶中，减压抽出气泡。
弃去部分蒸馏水，使蒸馏水与胶的体积比大致为1:2。
○2装柱：取一支30×3 cm 的层析柱，将处理好的Sephad ex G-25装柱，自然沉降。
○3处理：用2倍柱床体积的0.5 mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍体积的蒸馏水洗去残留的NaCl。
○4平衡：用20 mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0-1.5 ml/min。
紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出稳定的基线。
○5上样：将柱内的缓冲液液面流至于胶面相切，取20 ml鸡卵粘蛋白提取液上样，待样液液面流至于胶面相切，加入2-3ml缓冲液冲洗层析柱内壁，待溶液液面流至于胶面相切，然后加入缓冲液距胶面高度约2-3cm，以同样的流速洗脱。
○6收集：在检测仪上观察到开始出现第一个峰时进行收集，待出现第二个峰时停止收集。
见图1图1 Sephadex G-25分子筛层析分离图谱（2）Cellulose离子交换柱层析分离○(1 溶胀：称取20g DEAE-Cellul ose放入500ml的烧杯中, 加入150ml 蒸馏水，在室温下溶胀24小时。
○2装柱：取一支20×3cm 的层析柱，将溶胀好的DEAE-Cellul ose装柱，自然沉降。
○3再生：用200ml 0.5mol/L NaCl –0.5mol/L NaOH 混合溶液洗柱，再用蒸馏水洗至流出液的pH值达到pH8.0。
用200ml 0.5mol/L HCl溶液洗柱，再用蒸馏水洗至流出液的pH值达到pH6.0。
○4平衡：用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0ml/min。
紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出稳定的基线。
○5上样：将经Sephad ex G-25柱脱盐的卵粘蛋白溶液上样，用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，直到仪器绘出稳定的基线。
流速控制在1.0ml/min左右。
○6洗脱：用0.3mol/L NaCl - 20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液。
○7收集：在检测仪上观察到出现高峰时开始收集。
见图2（3）透析及丙酮沉淀图2，鸡卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱的分离○1透析：将经DEAE-Cellul ose柱分离的鸡卵粘蛋白转入透析袋内，对蒸馏水透析，隔一段时间换一次水，直到渗出液经AgNO3溶液检查无氯离子存在，即可。
○2调pH值：将透析好的鸡卵粘蛋白溶液，用0.1mol/L HCl 精确调至pH4.0（最好一次调成功），量体积。
○3丙酮沉淀：加入3倍体积的预冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，在冰箱内静止4小时以上或过夜。
○4离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000 rpm离心15min，收集沉淀。
○5干燥：将盛有鸡卵粘蛋白的离心杯放入真空干燥器中干燥。
○6收集鸡卵粘蛋白成品，冰箱保存。
6.活性测定（1）标准胰蛋白酶活性测定（2）自提鸡卵粘蛋白抑制活性测定（3）鸡卵粘蛋白含量测定具体操作见活性测定部分.【实验结果】1.计算鸡卵粘蛋白收率2.计算标准胰蛋白酶的比活性3.计算鸡卵粘蛋白的抑制活性。
【思考题】1.在用10% TCA提取鸡卵粘蛋白为什么将提取液的最终pH调到3.5？2.在用三倍体积丙酮沉淀鸡卵粘蛋白时，为什么第一次丙酮沉淀（10% TCA提取鸡卵粘蛋白离心后的上清液）要将pH调到3.5，而第二次丙酮沉淀（透析后的鸡卵粘蛋白液）中要将pH调到4.0？3.本实验为什么选择DEAE-纤维素阴离子交换色谱分离鸡卵粘蛋白？实验二胰蛋白酶粗提取【实验目的】掌握胰蛋白酶原、胰蛋白酶的基本性质以及蛋白酶提取、分离的基本原理和方法；学习胰蛋白酶活性测定的原理和方法。
【实验原理】胰蛋白酶通常是以胰酶原的形式存在于动物的胰脏或其他组织中。
在底物的诱导下或激活剂的作用下，酶原的C端水解，除去6肽转变成具有活性的胰蛋白酶。