远红外
10nm~200nm 200nm 380nm 780 nm
2.5 m
50 m
~380nm ~ 780nm ~ 2.5 m ~ 50 m ~300 m
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荧光基础理论
➢ 什么是荧光 ？
当紫外或可见光照射到某些物质上时，这 些物质就会发射出波长和强度各不相同的 光线，停止照射光照射时，这种光线马上 或逐渐消失，这就是荧光。
分子的去激发
无辐射跃迁 分子的去激发
辐射跃迁
振动弛豫 内转移 外转移 体系间跨越
荧光（F） 磷光（P）
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辐射跃迁
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振
动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。
由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，
温州大学 现代物理化学技术
荧光及荧光分析
陈伟
wchen@
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荧光及荧光分析
概述 基本原理 荧光分析 仪器与技术 应用与示例
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光学光谱区
远紫外 近紫外 可见光 近红外 中红外
（真空紫外）
于选择最适宜的激发波长。
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激发光谱与发射光谱
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荧光的发现及发展
1575年，西班牙医生N. Monardes首先发现荧光
1852年，Stokes发现荧光波长比照射光波长
要长，认定荧光是发射光。
1867年，首次用于分析测定。
1952年，商品荧光分光光度计出现。
2008年，日本村修、美国马丁·沙尔菲、美籍
S0
l1
l2
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l3 l 2
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荧光测量
光源
单色器
λ ex
I0
吸
收
池
It
狭缝
单色器
λ em
狭缝
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检测器
荧光的检测
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激发光谱与发射光谱
任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发 光谱与发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的 基础。 1）激发光谱
荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振 动能层间跃迁产生的；而磷光是由激发三重态的 最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。
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无辐射跃迁
系间窜越
指不同多重态间的无辐射跃迁， 例如S1→T1就是一种体系间跨跃。 通常，发生体系间跨跃时，电子 由S1的较低振动能级转移至T1的 较高振动能级处。有时，通过热
改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射 波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图 可得到激发光谱。
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激发光谱与发射光谱
激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经 校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的 过程就是分子的激发过程。
激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用
速率常数kf为106~109s-1。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态
所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的
改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。
在光照停止后，仍可持续一段时间。
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无辐射跃迁
振动弛豫 它是指 在同一电子能级中，电子由高振动 能级转至低振动能级，而将多余的能量以 热的形式发出。发生振动弛豫的时间为1012s数量级。
华裔钱永健因发现并发展了绿色荧光蛋白质技
术而获诺贝尔化学奖。
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单重态和三重态
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和 (0或1)；
单重态：全部轨道里的电子都是自旋配对的，S=0,M=1； 三重态：分子具有自旋不配对的电子，S=1,M=3. 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重 态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态；
hv h h A vF v
P
S1 T1
S0
激发，有可能发生T1→S1，然后 由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
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内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能 量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
T1 T2
发 射 磷 振动弛豫 光
激发态与基态中的电子自旋方向相反，称为激发单重态 （S）抗磁性 激发态与基态中的电子自旋方向相同，称为激发三重态 （T）顺磁性
区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。
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电子跃迁
➢ 处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无 辐射跃迁方式再回到基态。
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无辐射跃迁
内转换
当两个电子能级非常靠近以至其振动能级 有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射 跃迁方式转移至低能级。
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无辐射跃迁
外转移
指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互 作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消 失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。 荧光与磷光的根本区别：
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电子跃迁类型
允许跃迁
禁阻跃迁
基态单重态
激发单重态 激发三重态
S0
S1, S2, S3…… T1, T2, T3……
区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。
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电子跃迁类型
在单重激发态中，两个电子平行自旋， 单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿 命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其 激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和 T分别表示单重态和三重态）。
➢ 辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发 射；
➢ 无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能 量，包括振动弛豫（VR）、内转移（IR）、外 转移（EC）及系间窜越（ISC）等，各种跃迁方 式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构 及激发时的物理和化学环境等因素有关。
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