增加冲洗量 使用中和剂或灭活剂如β-内酰胺酶、对氨基苯甲酸
（影响磺胺类抗生素） 更换滤膜品种
供试品的无菌检查（薄膜过滤法）
供试品过滤 ↓
冲洗液过滤
阳性对 ↓
若出现隐约浑浊可染色镜检，
阴性对照：
溶剂和稀释液代替 供试品
或转种新鲜培养基，或接种斜面培养基
接种乳糖胆盐发酵管（产酸产气） 接种曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂 菌落特征相符且为革兰阴性无芽孢杆菌，接种乳
糖发酵管（产酸产气）
可能的大肠菌群数表
各供试品量的检出结果
可能的大肠菌群数N
0.1g或0.1ml 0.01g或0.01ml 0.001g或0.001ml （个/g或ml）
＋
＋
＋
＋
＋
＞103
若供试品有抑菌作用
薄膜过滤法 中和法 培养基稀释法 离心沉淀法
（2）大肠菌群（埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷 伯菌属、肠杆菌属）
分组
① 验证组：供试液+100cfu试验菌株 ② 阳性对照：100cfu试验菌株 ③ 阴性对照：稀释液 ④ 检查组：供试液（0.1ml、0.01ml、0.001ml）
1. 药品中微生物的来源
① 空气中的微生物（生产场所） ② 水中的微生物（液体制剂） ③ 人体中的微生物（操作人员） ④ 土壤中的微生物（植物药材） ⑤ 原料和包装物 ⑥ 厂房建筑和制药设备
2. 微生物引起的药物变质 存在于药物中的微生物如遇到适宜的条件就能
生长繁殖，使药物发生变化，造成药物变质失效
第二十章-药品的微 生物学质量控制
王重振 副教授 wangchongzhen@
学习要求
掌握一般灭菌制剂的无菌检查方法、非灭 菌药物的微生物总数测定方法
熟悉药品的控制菌检查方法、药品生产中 防止微生物污染的主要措施
了解药品中微生物的来源和微生物引起的 药物变质
第一节 药品生产中的微生物污染
（1）外在表现（味道、气味、色素、沉淀、产气等） （2）判断（外在表现、微生物及其代谢产物检查） （3）药物变质的结果
① 引起感染 ② 药物失效 ③ 微生物有毒代谢产物致病
第二节 药品生产中防止微生物污染的措施
1. 加强药品生产管理
国家实施GMP管理规范，对厂房与设施、设备、物料与产品 等有严格要求
无菌检查必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染
1. 薄膜过滤法（首选）
直径：50mm 孔径：小于0.45μm
薄膜过滤法的验证
供试品过滤 ↓
冲洗液过滤 ↓
100cfu试验菌过滤 ↓
滤膜接种于培养基
对照1：
试验菌直接接种 培养基
验证滤膜可截留试验菌，并且试验菌生长不受供试品被 截留物的抑制
若供试品有抑菌作用
供试品的微生物总数测定（平皿法）
不同稀释级供试品 ↓
培养基
阴性对照：
溶剂和稀释液代替 供试品
2. 薄膜过滤法
薄膜过滤法的验证
分组
① 试验组：最低稀释级供试品+100cfu试验菌 ② 菌液组：100cfu试验菌 ③ 供试品对照组：最低稀释级供试品 ④ 稀释剂对照组：稀释剂+100cfu试验菌
2. 药品生产的GMP验证
灭菌工艺的验证
3. 使用合格的防腐剂 4. 进行微生物学检验 5. 药物非临床研究质量管理规范
药物非临床安全性评价研究机构 动物、植物、微生物以及器官、组织、细胞、基因等
第三节 药品的微生物学检查
一、无菌制剂的无菌检查
各种注射剂、输液、手术眼科制剂都必须保证无菌，符 合药典相关规定
冲洗液过滤 ↓
滤膜接种于培养基
阴性对照：
溶剂和稀释液代替 供试品
（二）控制菌检查（非灭菌制剂）
（1）大肠埃希菌 分组
① 验证组：供试液+100cfu试验菌株 ② 阳性对照：100cfu试验菌株 ③ 阴性对照：稀释液 ④ 检查组：供试液
增菌培养基：胆盐乳糖培养基 鉴定
① MUG试验（+）和靛基质试验（+） ② 单阳性则接种曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂，观察菌落 ③ 分离、纯化、镜检、其他鉴定试验
阳性对照： 阳性对照菌与供试 品共同接种培养基
阴性对照： 溶剂和稀释液代替 供试品
二、非灭菌制剂的微生物限度检查
（一）细菌、霉菌及酵母菌计数 1. 平皿法
平皿法的验证
分组
① 试验组：最低稀释级供试品+100cfu试验菌 ② 菌液组：100cfu试验菌 ③ 供试品对照组：最低稀释级供试品 ④ 稀释剂对照组：稀释剂+100cfu试验菌
流程
供试品过滤，冲洗，试验菌过滤，接种培养基
结果判断
稀释剂对照组÷菌液组×100%≥70% （试验组－供试品对照组）÷菌液组
×100%≥70%
若供试品有抑菌作用
中和法 离心沉淀法：500转/分钟，离心3分钟，取上清检查
供试品的微生物总数测定（薄膜过滤法）
不同稀释级供试品过滤 ↓
培养基 结果判断
稀释剂对照组÷菌液组×100%≥70% （试验组－供试品对照组）÷菌液组
×100%≥70%
若供试品有抑菌作用
供试品溶液性状允许的情况下，尽量选用薄膜过滤法 中和法 培养基稀释法：每1ml的供试品可等量分注多个平皿 离心沉淀法：500转/分钟，离心3分钟，取上清检查
局部给药制剂：均不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿 假单胞菌
鼻及呼吸道给药制剂：不得检出大肠埃希菌 阴道、尿道给药制剂：不得检出梭菌和白念珠菌
谢谢！
无菌检查试验菌株
① 大肠埃希菌-CMCC（B）44102 ② 金黄色葡萄球菌-CMCC（B）26003 ③ 枯草芽孢杆菌-CMCC（B）63501 ④ 生孢梭菌-CMCC（B）64941 ⑤ 白念珠菌-CMCC（F）98001 ⑥ 黑曲霉-CMCC（F）98003
－
102＜N＜103
＋
－
－
10＜N＜102
－
－
－
＜10
（3）沙门菌 （4）铜绿假单胞菌 （5）金黄色葡萄球菌 （6）梭菌 （7）白假丝酵母菌
增菌培养基、鉴别方法各异
（三）活螨的检查
一旦检出即判供试品不合格
（四）微生物限度标准（总数、控制菌）
无菌制剂 口服制剂：不得检出大肠埃希菌
含动物脏器：不得检出沙门菌
2. 直接接种法 3. 验证
试验菌 ↓
培养基 ↓
加入供试品
验证试验菌生长不受供试品抑制
对照： 不添加供试品
若供试品有抑菌作用
增加培养基的用量 使用中和剂或灭活剂如β-内酰胺酶、对氨基苯甲酸
（影响磺胺类抗生素）
供试品的无菌检查（直接接种法）
供试品 ↓
培养基 ↓
若出现隐约浑浊可染色镜检， 或转种新鲜培养基，或接种斜面培养基