收稿日期:2000-03-13作者简介:郝林,山西农业大学食品系食品微生物教研室主任、副教授、硕士研究生导师。

糖化黑曲霉复壮方法的研究郝　林1,陈立新2,司俊玲1,贾　莉1(1山西农业大学食品科学系,山西太谷030801;2山西省太谷县科委,山西太谷030800)摘要:采用透明圈法对糖化黑曲霉AS31324和AS314309的复壮方法进行研究,选出了三种适合的筛选培养基,确定了具体的操作步骤。

复壮后菌株的麸曲糖化酶活力分别比退化的出发菌株的麸曲糖化酶活力提高45%和44%。

关键词:透明圈;糖化酶活力;黑曲霉;复壮中图分类号:TS26111+2;TS26111+5文献标识码:A 文章编号:1002-8110(2000)03-0045-03黑曲霉是我国白酒及食醋企业使用的重要糖化菌。

在一些中、小企业中,由于缺少微生物学方面的专业人员,对微生物的遗传变异及菌种退化缺乏了解,因而对生产菌种退化无力解决,只好定期购买菌种。

实际上,菌种退化是指群体中退化个体在数量上占一定数量后,所表现出的菌种生产性能的下降。

因此完全有可能采取一些相应措施,使退化菌种复壮。

狭义的复壮是指已发生退化的菌种,通过纯种分离和性能测定等方法,从退化的群体中找出尚未退化的少数个体,以恢复该菌种原有典型性状的一种措施。

广义的复壮则是在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行纯种分离,以期使菌种的生产性能逐渐提高,它实际上是一种利用自发突变在生产中进行选种的工作。

本研究根据上述原理,经过对有关资料介绍的方法进行试验比较,得到了一种较好的透明圈筛选方法。

1　材料与方法111　菌种AS31324和AS314309均为本教研室多年传代保藏的材料。

112　设备及器皿高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电炉、酒精灯、三角瓶、培养皿、试管、吸管及糖化酶活力测定所需用具等。

113　培养基及试剂A 培养基:可溶性淀粉10g 、NaNO 3lg 、K C1015g 、K 2HPO 4015g 、MgS O 417H 2O 015g 、琼脂20g ,加水至1000ml 、自然pH 。

B 培养基:蛋白胨10g 、淀粉10g 、NaNO 33g 、K Cl 015g 、FeS O 40101g 、K 2HPO 41g 、MgS O 4015g 、蔗糖20g 、琼脂18g 、水1000ml 。

C 培养基:NaNO 33g 、K 2HPO 41g 、K Cl 015g 、MgS O 4015g 、FeS O 40101g 、琼脂20g ,麸皮150g 加少量水浸泡30min 后用纱布过滤,再次加水过滤一次,将两次得到的麸皮浸出液加水定容至1000ml [1]。

D 培养基:可溶性淀粉4g 、蛋白胨10g 、NaCl 5g 、牛肉膏3g 、琼脂20g 、加水至1000ml ,pH712[2]。

碘液:首先将碘化钾2g 溶于5-10ml 水中,再加入碘1g ,使其溶解后加水至300ml 。

114　试验方法11411　为了避免非退化性的种性变化给复壮分离工作带来的失误,对于在冰箱中经过长期保藏的菌种,在进行复壮分离前要进行菌种活化,使菌种中的不同个体能够充分表达出它应有的个性。

菌种活化就是将保藏的试管斜面菌种转接到新的试管斜面上,经过培养,待长出孢子后再转入另一支试管斜面上培养,待长满孢子后备用。

如果用于复壮分离的菌种是新转接的菌种或是新制成的种曲,则可省去活化过程。

・54・2000年第3期(总第138期)N o 13　2000　T ol 1138 酿 酒NIANGJ IU 11412　将上述四种培养基分别加热溶解及融化,装入三角瓶中,在011MPa 、121℃灭菌20min ,然后倒入培养皿中制成平板备用。

11413　挑取经过活化的菌种孢子,接入内含10ml 无菌水的试管中,制成孢子悬液,并在此基础上,继续稀释成10-3、10-4等稀释度的孢子悬液。

稀释时可利用血球计数板推断选择适宜稀释度的孢子悬液。

方法是当整个计数室中只有一个孢子时,可再经过100至1000倍稀释,使每011ml 孢子悬液含孢子10个左右。

本试验选择10-3、10-4两个稀释度的孢子悬液进行平板涂布接种,用1ml 无菌吸管吸取孢子悬液011ml 注入平板内,用三角形玻璃棒涂布器在培养基平板表面均匀涂布,然后盖上皿盖。

11414　将培养基平板倒置于培养箱内30℃培养3-4d ,用碘液作显色剂,倒于菌落周围轻轻旋转平板使碘液均匀铺满整个平板,3-4min 内测量菌落周围的透明圈及菌落大小。

该圈的形成是由于微生物产生淀粉酶使菌落周围的淀粉水解,因而不能与碘形成淀粉—碘络合物呈现蓝色。

11415　挑取生长快、透明圈宽的菌落中心部的孢子移入试管斜面上培养使其长出孢子成为初筛试管菌株。

11416　对初筛菌株进行三角瓶小样制曲。

三角瓶麸曲培养基的配制方法:麸皮150g 、水140ml ,用H 2S O 4调至pH415-5,物料拌匀后装入三角瓶内以115cm 厚为宜,121℃、30min 灭菌后摇散冷却备用。

接种时从试管菌株斜面上挑取3环孢子,接入三角瓶内摇匀后,置于30℃培养箱内培养,等物料结饼明显时进行扣瓶培养,使上下部分菌体生长一致,当孢子略发褐色或黑色时停止培养,自然风干后进行糖化酶活力测定。

注意避免阳光直射和过高温度。

11417　糖化酶活力测定采用G B8276-87方法[3]。

2　结果与分析211　不同筛选分离培养基的培养效果由表1可见,除A 培养基外其余3个培养基均适合AS31324和AS314309生长。

C 培养基透明度差,对透明圈的观测有妨碍,需要对麸皮浸出液采取更好的过滤方法加以解决。

212　筛选菌株性状表现表1四种筛选培养基的培养效果比较(30℃、72h )培养基菌株平均菌落直径(mm )培养基状况A AS31324AS31430911平板透明B AS31324AS314309615214平板透明C AS31324AS3143091016618平板混浊不透明D AS31324AS314304715615平板透明 表2　初筛菌株的透明圈和糖化酶活力初筛菌株培养基培养时间(h )菌落直径(mm )透明圈宽(mm )麸曲糖化酶活力(u/g )小样麸曲长势AS31324-h1D 7271142743强、快AS31324-h2D 87832082强、快AS31324-h3D 87832140强、快AS31324-h4D 87933526强、快多年传代的AS313242436中AS314309-h1C 72542871强、快AS314309-h2C 7231533631强、快AS314309-h3C 72443103中AS314309-h4B 8722112726强、快AS314309-h5B 87222088AS314309-h6B 87222569强、快AS314309-h7B 87333187强、快AS314309-h8B 8722153045强、快AS314309-h9B 96543103强、快AS314309-h10B 96552709中AS314309-h11B 96552122强、快AS314309-h12B 96553056强、快AS314309-h13B96553085中多年传代的AS3143092523中 由表2可见,AS31324在D 培养基上可形成适当宽度的透明圈,AS314309在C 、B 培养基上都可以形成较宽的透明圈。

透明圈的宽窄与酶活力、培养基成份及培养条件有关。

适宜的宽度对直观比较不同菌株之间酶活力大小是重要的。

透明圈不应过窄、边缘应当清楚。

本试验中的透明圈都十分明显、边缘・64・ 酿 酒NIANGJ IU 2000年第3期(总第138期)N o 13　2000　T ol 1138 清楚且大小适宜。

所选菌株AS31324-h4麸曲糖化酶活力达3526u/g ,比本教研室多年传代的AS31324麸曲糖化酶活力提高45%。

所选菌株AS314309-h2麸曲糖化酶活力为3631u/g ,比本室多年传代的AS314309麸曲糖化酶活力提高44%。

在制备三角瓶小样麸曲时发现,所选菌株AS31324-h4和AS314309-h2都比原出发菌株生长快、长势强,制曲培养时间缩短。

3　结论进行糖化黑曲霉复壮可利用本研究所使用的B 、C 、D 三种培养基,通过纯种分离并结合透明圈宽度大小进行初筛,然后再结合糖化酶活力测定进行复筛,最后选出最佳菌株。

当然菌种的复壮除了应考虑主要生产性状外,还应兼顾其它次要生产性状。

C 培养基透明度差可以在麸皮浸出液制备时把用双层纱布过滤改为用脱脂棉过滤加以解决。

研究中发现透明圈宽度的大小及与其菌落直径比值的大小,在小范围内并不与糖化酶活力的高低简单对应。

因此,笔者认为透明圈宽度的大小只能作为初筛的依据,对某菌水解淀粉能力的强弱进行初步判断。

初筛一定要保证足够的数量,避免漏掉优良的菌株。

只有依据糖化酶活力实测结果进行复筛,才能保证筛选出好的菌株。

菌种复壮是一项细致复杂的工作,需要长期坚持进行,使生产菌株的生产性能不但不退化,而且能逐渐提高。

[参考文献][1]罗维,孙高翔,刘永婷等1应用曲霉菌淀粉酶透明环育选菌种的研究[J ]1酿酒,1997,(3):28-291[2]谢广发,夏祖宏1筛选糖化菌的方法—透明圈法[J ]1中国酿造,1998,(1):301[3]上海市酿造科学研究所1发酵调味品生产技术(修订版)[M]1北京:中国轻工业出版社,1998,65-691Studies on R ejuvenescent Method of Saccharifying Aspergillus nigerHao Lin 1,Chen Li -Xin 2,Si Jiun -ling Jia Li1(Department of F ood Science ,Shanxi Agricultural University ,T aigu 030801China )Abstract This paper studied the rejuvenescent method of saccharifying Aspergillus niger AS 31324and AS314309,used the transparent ring 1The results were to obtain three kinds of suitable medium and concrete operative step 1The saccharifying enzymic activity of rejuvenated strains were separately 45percent and 44percent m ore than degenerate original AS 31324and AS3143091K ey Words :T ransparent ring ;Saccharifying enzymic activity ;Aspergillus niger ;Rejuvenation白酒生产许可证开始发放发证工作结束后,无证企业将被严厉查处据悉:国家质量技术监督局从4月开始审批和发放白酒产品生产许可证。