动物医学院专题讨论
克隆表达与引物设计
Clone,Expression,and Prime Design
克隆表达的路线
目的DNA片段和载体的制备
目的DNA片段和载体的连接
重组子筛选 什么是克隆？ 表达的目的 载体的选择 引物的设计是关键
连接产物的转化
目的蛋白的诱导表达 目的蛋白的纯化
目的基因的克隆及其原核表达 技 术 路 线
程序：
3’ Antisense primer
引物
←
5’
dNTP 上游引物 下游引物 模板 Taq 酶
95℃ 变性5min； 94℃ 变性30s，
52℃ 退火30s， 72℃延伸40s，
3）和条件
引物设计的原则
1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
2. 产物不能形成二级结构；避开产物的二级结构区。自由能△G°≥58.6l kJ/mol。 3. 引物长度一般在15~30碱基之间。 4. G+C含量在40%~60%之间。 5. 碱基要随机分布。 6. 引物自身不能有连续4个碱基的互补；引物之间不能有连续4个碱基的互补。 7. 引物5′端可以修饰；引物3′端不可修饰。 8. 引物3′端要避开密码子的第3位。
3. 分析所要扩增的基因片段，对其保守性，抗原优势位点等进行分析。
4. 利用软件，参照引物设计的原则，进行引物的设计。
引物设计目的和PCR扩增
PCR引物设计的目的：
找到一对合适的核苷酸片段，使其能够有效的扩增模板DNA。
Sense primer
3’ 5’
→
ddH2O 10×buffer
17µL 2.5µL 1µL 1µL 1µL 2µL 0.5µL
HEV
RNA Extraction
RT-PCR
HE
PCR Vector TProductA Vector T A
pET HE
转化 DE 3
大肠杆菌
HE蛋白
ITPG诱导
实验目的与引物设计
1. 明确实验的目的，根据实验目的设计引物。 2. 选择表达载体，根据载体的酶切位点，在引物的5‘端加入酶切位点。