干血点采样和微透析技术在药动学研究中的应用摘要：药动学研究过程中，传统的取样方法存在一定的缺陷，使新的方法应运而生，干血点采样技术和微透析技术就是其中两个。

本文就它们的原理、目前在药动学方面的应用现状、优点与不足之处作概述。

关键词：干血点采样微透析技术药动学进行药动学研究通常需要从生物体采集大量的全血（临床前试验每个时间点通常采集 100～500μl，临床试验 1～5 ml）以获得足够的血浆用于生物定量分析。

应用传统的方法，在临床前试验中，每只动物只能获得一定体积的全血，如果用血量大，则需要将多只动物的血样混合，这往往导致药动学数据的可靠性下降，而且对动物的需求量增加。

另外，血浆的处理要使用固相萃取、液液萃取或者蛋白沉淀等方法，这些步骤耗时耗力，限制了检测通量和样品检测数量。

最后，血样的运输和储存也存在实质上的困难，运输以及储存过程需要冻存并妥善处理。

由此可见，研究新的采样方法对药动学的研究有着不容忽视的意义。

本文就两种非传统采样方法进行综述。

1.干血点采样技术干血点采样（dried blood spot，DBS），即将全血样品收集在卡纸上，作为一种采集生物样品的新型替代技术，在血样采集方法上比传统方法有一定的优势。

它需求较少的血量（通常小于 100 μL），可减少动物使用，方便血样采集、存储运输，简化样品前处理。

特别适合小动物的连续样品采集。

有关DBS样品采集、干燥、储存和运输、前处理等方面的综述如下：1.1 DBS 样品采集方法1.1.1 DBS 采样卡FTA 和 FTA Elute 卡，可用于 DBS 采样，两种卡通过适宜的化学试剂处理后，具备溶解细胞，使蛋白变性，并且抑制细菌等其他微生物生长的功能。

1.1.2 DBS 样品采集过程在临床前研究中，小动物（如小鼠、大鼠）可以从尾部采血。

血样可直接滴到采样卡的圆圈内，应避免直接接触到卡纸，尤其是在采样前和血样未干燥前。

还应避免凝血、分层以及过饱和等情况的发生。

血样应均匀分布在圆圈内，采样卡两侧血样的颜色应保持一致。

如果样品被污染，出现溶血现象或者采样体积不够，均为不合格的采样。

也可以使用加样枪将血样点到采样卡上，这样可避免潜在的血细胞比容差异、采血量的影响、血样在采样卡上分布不均匀等采样错误。

加样枪头应距离采样卡若干毫米，当血样碰触到卡时会迅速分散开，使血样在卡上分布均匀。

1.2 DBS 样品干燥、储存和运输方法在储存和运输前将 DBS 样品充分干燥是十分重要的。

一般而言，在室温开放环境（15～22 ℃）下，干燥时间至少为 2～3 h。

干燥时间取决于采样卡的类型以及采血量的多少。

样品不应该加热、重叠放置或者接触其他表面，需要的话应避免阳光直射。

潮湿可能引起细菌生长，改变提取效率或者促进不稳定分析物的降解，从而导致血样的分析质量下降。

因此在干燥之后，为避免 DBS 样品接触水分或湿气，可用纸覆盖 DBS 样品并装进含有干燥剂的封口袋里，另外，包装袋内应含有湿度指示剂。

通过这种方式包装的 DBS 样品可在室温下储存数周至数年。

如果样品含有不稳定的化合物，则应储存在低温环境（2～8 ℃、≤−15 ℃或≤−60 ℃）。

按照上述方法包装的 DBS 样品可通过邮寄方式运输，在此期间不需考虑血样暴露或者传染性物质等问题。

1.3 DBS 样品前处理方法1.3.1 打孔位置的选择为考察全血在 DBS 卡上的分布情况，根据干血点的直径大小，选择中心及边缘位置打孔得到相同尺寸的滤纸片，处理后进行样品分析，随行标准曲线测定其浓度。

研究表明，打孔位置会直接影响DBS 样品定量分析的结果。

如果点卡体积小而打孔面积大，那么所测结果的精密度会比较好；如果点卡体积大而打孔面积小，那么所测结果的精密度会比较差，原因可能是卡纸成分的干扰。

唯一能精确地对待测物进行定量分析的方法为点卡体积完全相同，从卡上取下所有的血点。

1.3.2 离线提取在定量分析中，从 DBS 卡上打下一个或多个一定直径的圆片放入分析试管或 96 孔微量滴定盘中进行提取。

提取时通常加入一定量的含有内标的提取溶剂（甲醇、乙腈或者一定比例的水-有机溶剂混合物）。

选择合适的提取溶剂破坏基质或滤纸里分析物与蛋白的结合，并通过振荡或者涡旋等方式将分析物洗脱下来，涡旋时间一般为20～60 s，必要时也可采用超声处理来提高提取效率。

离心之后，提取物手动或自动转移到试管或微量滴定盘中直接进样，或者吹干后用流动相复溶进样。

1.3.3 在线提取最近有报道关于 DBS 样品的在线提取方法。

该方法基于“inox cell”结构，可以将滤纸片上的分析物洗脱下来，随即导入 LC-MS 系统，从滤纸上释出的分析物通过色谱分离后进入质谱检测。

1.4 样品稳定性根据 DBS 的采样情况，应对分析物（以及代谢物）在室温下不同介质以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定 DBS 的存放条件和时间。

具体的稳定性试验应包括储备液的稳定性、样品处理后的溶液中分析物的稳定性、分析物在全血中的稳定性、含药全血点样后室温放置的稳定性、含代谢物全血点样后室温放置的稳定性等。

1.5总结相较于传统的血浆采集方法，在药动学研究中使用 DBS 采集全血样品具备了一定优势。

但是作为一种新方法，DBS 法尚存在以下不足。

测定结果的准确性可能受点样条件（工具、温度、体积）影响；样品量少，灵敏度不高；不适用于不稳定的药物（如易于氧化、酶解的药物）。

虽然 DBS 技术还处在开发期，有待完善，但其较一般样品采集及处理方法显示出的优点使其在药动学研究的应用范围越来越广泛。

2.微透析技术2.1 基本原理微透析技术可在基本不干扰生物体正常生命过程的情况下进行在体、实时和在线取样与检测。

其原理是基于物质自由扩散，将具有一定孔径的纤维半透膜制成探针（probe）植入待测的组织内，以恒定速度向探针内灌流与组织成分相似的等渗灌流液。

当灌流液流经探针的顶端时，组织内小分子量生物活性物质即顺浓度梯度从膜外扩散至膜内，并随灌流液被引流至探针外，按一定的时间间隔连续收集透析液，用现检测仪器检测其中待测生物活性物质水平，可监测该区域内细胞外生物活性物质浓度的经时变化过程。

2.2 系统组成微透析系统的组成主要分为四个部分，微注射泵、微透析探针、微收集器以及连接这些部分的导管。

其中最主要的部分是微透析探针。

微透析探针有多种类型，同心圆型的探针是现在应用最为广泛的探针。

这种探针是一种顶端连有半透膜的同心圆型套管，主要应用于脑内微透析实验。

除了同心圆形探针外还有柔性探针、线性探针、分流探针等，每种探针所应用的条件是不同的，在实验时需要根据实验的具体要求来选择不同类型的探针进行实验。

2.3 技术特点微透析方法与传统的方法相比，主要具有以下几个方面的特点：（1）微透析技术可以实时监测目标化合物在体内的分布以及多种化合物在靶器官内的浓度随时间变化的趋势。

这就为研究药物在体内的分布、吸收、代谢及排泄过程提供了有力的手段。

（2）微透析技术既可以在麻醉动物身上取样，也可以在自由活动的清醒动物身上取样，且对动物的组织损伤小，能从同一动物收集大量的样本而不损失体液量，从而避免了传统研究方法中因采血后血容量减少所造成的对药物分布及消除的影响。

微透析技术方法应用于药物代谢动力学的研究，减少了实验动物的使用量，排除了个体差异对实验结果的影响（在同一只动物身上可以得到一套完整的药动学参数），保证了实验结果的准确性。

（3）微透析取样技术所采集的样本是不含蛋白质等大分子物质的游离态小分子化合物，其结合现代检测方法后，可以不经过预处理直接进行分析，减少了样品的损失和误差，使得到的药动学参数的可靠性和准确性也相对较高。

且由于蛋白质无法通过微透析探针的半透膜，故不会因在室温取样而发生酶解反应，提高了样品的稳定性。

2.4微透析取样技术在药动学研究中的应用2.4.1 微透析取样技术在脑内药动学研究中的应用脑微透析技术采用了截留不同分子质量物质的透析膜制成微透析探针,利用脑立体定位仪将探针埋入指定的组织区域,将灌流液以一定速率泵入探针进液管,脑细胞外液中的小分子生物活性物质或药物根据Fick's定律通过探针中具有一定孔径的透析膜,顺浓度梯度在细胞外液与灌流液之间扩散,随着灌流持续进行,膜内的灌流液随时更新,膜两侧浓度梯度得以维持,因此小分子物质可持续顺浓度梯度扩散,以一定时间间隔收集探针流出液并采用高灵敏的分析技术进行定量分析,从而实现对脑特定部位细胞外液中生物活性物质的动态监测。

由于物质顺浓度梯度跨膜运动可双向进行,所以脑微透析技术除了用作动态监测脑内细胞外液的的生化改变,还可作为一种给药途径用于脑内特定部位的给药。

微透析技术在测定药物向脑内分布和转运具有明显的优势，且微透析探针的刚性结构适合于脑内试验，结合脑立体定位仪可以准确的定位到脑内的各个分区，且具有很高的时间分辨率和空间分辨率。

脑微透析技术为研究脑内的神经递质改变、特定部位细胞外液药物浓度的监测等提供了有效的技术支持。

但作为一门新兴的技术,它仍存在一些问题,包括缺乏准确易操作的探针回收率校准方法和可满足小体积、低浓度的灵敏的分析方法、微透析探针植入对脑内环境的影响不确定、目前只能通过微透析技术采集小分子物质、亲脂性药物易产生吸附、可重复使用性差导致成本高等,这些都限制了其在PK和PK/PD研究中更广泛的应用。

2.4.2 微透析取样技术在外周组织及血液药动学研究中的应用2.4.2.1皮肤对皮肤及皮下脂肪组织的药动学研究传统的方法有起疱技术、皮肤刮取术、胶带剥离术等，但这些方法都无法反映皮肤局部药物的吸收过程，且会出现皮肤变性、细菌生长等问题。

DMD技术能进行在体原位检测，对皮肤破坏小；可选择性地采集非结合性药物；可同时在多位点进行采样。

与此同时，DMD具有能同时采集外源性和内源性化合物的特点，因此近年来，该技术在皮肤病生理机制及药效机制研究领域发挥着重要的作用，成为少数适合于研究皮肤药动学进而评价经皮制剂生物利用度和生物等效性的研究方法之一。

2.4.2.2 眼对眼药的药动学研究中微透析方法也能适用。

可以获得药物在眼局部的吸收、分布及从眼部消除的资料。

微透析法应用于眼科药代动力学研究中不仅能使实验的准确度更高，而且能节省实验动物，减少动物不必要的损失。

2.4.2.3 胆胆微透析技术是微透析技术的一种，是一门新兴的"用途广泛的技术，是将一种具有透析作用且充满液体的微细探针置于胆管内，与探针周围组织进行物质交换后测定其内的化学物质含量的技术，能直接"有效地对胆汁中的药物及其代谢产物浓度进行持续检测，是药物动力学研究的重要工具，具有不可替代的作用及广阔的应用前景。

2.4.2.4 血液药动学分析方法最常用的方法是血药浓度法。