细胞培养基上清提取外泌体
外泌体产生细胞（Exosome源细胞）的选取：
293T细胞：常用于基因改造外泌体；
Mouse immature dendritic cells（imDCs）：小鼠未成熟的树突细胞，常用于小鼠in vivo 体内反应使用，产生的外泌体引起的免疫反应极小；
Mouse lymphoma cell line（EL-4）：小鼠淋巴细胞；
各类癌细胞系：常用于研究各个癌产生的外泌体本身特性研究:
……
不同实验的需求不同， Exosome源细胞的细胞选择不同，例如：需要基因改造就选择较容易感染的293T，体内实验就要避免机体的免疫反应，要充分了解实验要求和各个细胞系背景。

Exosome源细胞用量：
以293T为例，2个15cm盘=4.5个10cm 盘=4*107 cells，最终的Exosome 20ul/20ul 可用于体内原位癌3*104/1ul注射给药，15ul/50ul 可用于105 受体细胞培养加药。

P S: 王红阳方法1ug Exosome=5*106 cells，原位癌注射用量5ug，105细胞培养用量1ug。

我约莫算了一下，差不多。

楼上的方法不要定量，更简单方便，以楼上为主。

以293T细胞为例制备Exosome：
1.2盘10cm 盘在60-70%进行病毒感染，1盘感染GFP（control病毒），1盘感染plv-cs
2.0-myc-PD1，病毒感染后16-18h后换液；
2.36-48h后进行传代：准备10盘10cm盘，每盘加入15ml Exosome-free的10%血清的DMEM，放入37°C培养箱备用。

取出2感染好的2盘细胞，迅速用5ml PBS/遍洗涤3遍，加入1ml胰酶，摇匀使每个细胞都孵育胰酶，37°C静置消化1min，加入4ml Exosome-free 的10%血清的DMEM静置，获得5ml细胞悬液，加入到准备好的10盘10cm盘中，获得5盘GFP、5盘plv-cs2.0-myc-PD1稳转293T 细胞系，37°C培养48h；
3.取4根灭菌处理过的50ml管，收集细胞培养基，分装成37.5ml GFP、plv-cs2.0-myc-PD1各两管，进行三步法离心：
✓4°C离心200-300g，5min去细胞，分别小心吸取上清34ml入新的灭菌50ml 管；
✓4°C离心12,000-16,000g，45min去碎片，分别吸取31ml上清入新的灭菌50ml 管，0.22um滤膜（Millipore）过滤，最后62ml左右汇入一管Beckman快速密
封管Beckman Quick seal tubes；
✓Beckman 70Ti 转子4°C超离100,000-110,000g，90-120min，弃上清，用50ul PBS重悬exoxome。

3’.收取上清，进行三步法离心：200-300g 5min去细胞；12,000-16,000g 45min去碎片，0.22um滤膜过滤，用100kDa的超滤管（Millipore）将上清浓缩至200ul，加入15ml PBS 浓缩至50ul。

4.取 1、3、5、15ul/50ul 的Exosome 加入105受体细胞中，培养48h，观察或检测目的基因、药物的摄入情况。

（GFP观察荧光，RNA用RT-PCR，蛋白用WB）。