焦磷酸测
序技术
Titanium www.roche 序法/DNA 400bp 10h
Series
-applied- 聚合酶
science.co
m
99.5（2） 9000
单分子测 GenoCare 瀚海基因 边合成边
/
序技术
/www.direc 测序/DNA 600bp
tgenomics. 聚合酶
com
视频原理
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Sanger测序技术——双脱氧末端终止法测序
视频原理
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三、高通量测序
高通量测序技术（High-throughputtsequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation” sequencingtechnology）， 能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。主 要 指 以Roche/454 焦磷酸测序、 Illumina/Solexa 聚合酶 合成测序和 ABI/SOLiD 连接酶测序，为代表的测序技术 。人类全基因组约30亿个DNA碱基对（1）；因此使用一代测序 对人类基因组进行全基因组测序在速度慢与测序成本高都急需突破。
2012: Article ID251364.
2、Gilles A, Meglécz E, Pech N, Ferreira S, Malausa T, Martin JF. Accuracy and quality assessment of 454 GS-FLX Titanium pyrosequencing. BMC
（B）焦磷酸测序
（2）高通量基因测序图像处理与数据分析_叶丙刚14
三、高通量测序——焦磷酸测序原理
G A T C
视频原理
15Байду номын сангаас
四、单分子测序-瀚海基因三代单分子靶向测序技术
三代基因测序仪的研发，首先要突破 三大核心技术难点
全内反射荧光显微技术 虚拟终止碱基 单分子碱基识别
图a
图a Single molecule targeted sequencing for cancer gene mutation detection
人基因组总共3G。一般做全 基因组测序需要30-40x的覆 盖度（保证一定的测序质 量），因此测序一次全基因 组得到的数据量将有90-120G。
（1）、Science（2001）291：1304-1351
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三、高通量测序——焦磷酸测序原理
焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是：引 物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和 三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起 来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。 焦磷酸测序技术的反应体系：反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物：5’-磷酰硫酸 (adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。
2、Emulsion PCR（乳液PCR） 将这些ssDNA分别单独与水油包被的直径大约28um的磁珠在一
起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序 列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。 同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个磁珠 结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增，扩增产物任 可以结合到磁珠上。 反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增 反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一 步测序反应所需的模板量。
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三、高通量测序400-800bp，将用于后续的扩增测序的接头A和一段含有生物素的接头B连接到DNA
片段上，会产生含有接头AA、AB、BB、BA四种DNA片段，然后与可结合生物素的磁珠结合，其中片段AA被洗脱掉， 片段AB/BA/BB结合到磁珠上，通过变性处理回收含有接头A和接头B的单链DNA。
测序技术的原理及应用
汇报人：胡安中
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核酸的常识与PCR 一代测序-sanger 二代测序-焦磷酸法 单分子测序-瀚海基因 测序技术的应用
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一、核酸的常识-核酸的组成
核酸（DNA或RNA） 核酸酶水解
碱基(base)：主要指腺嘌呤（adenine，A） 和鸟嘌呤（ guanine, G），胞嘧啶 （ cytosine, C）胸腺嘧啶（thymine，T） 和尿嘧啶（ uracil, U）
次只进一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸，这个焦磷酸在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、 荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酶4种酶的协同作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光 素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。 记录并分析这些 荧光信号，就可以获得高质量的DNA序列。（2）
content.
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全基因组测序数据分析面临的问题 1、数据存储 2、数据分析效率 3：筛选致病变异 4：未知基因致病性
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四、单分子测序-瀚海基因三代单分子靶向测序技术
单分子全内反射显微成像技术TIRF
单分子荧光成像技术 单分子荧光测序采用高灵敏度宽视野
的全内反射荧光（TIRF）显微成像技术， 可直接观测到极微弱的碱基单分子荧光信 号。通过精心设计的TIRF照明系统在芯片 表面产生倏逝波，仅允许芯片表面200nm 深度以内的荧光分子被激发，消除了光路 中的绝大多数背景噪声，因而能获得极佳 的信噪比以识别出单个碱基信号，200nm 深度，理论最高读长为600个碱基
Golden Rice
GIF1基因 控制水稻灌浆和产量 Ertao Wang et al. Nature Genetics，2008（11）,40,1370-1374 Control of rice grain-filling and yield by a gene with a
potential
Nature Biotechnology , 2005 , 23 (4) :482-7 Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A
常规PCR
测序PCR
上机测序与分析
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Sanger测序技术——双脱氧末端终止法测序 什么是双脱氧核糖核苷酸——ddNTP？
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Sanger测序技术——双脱氧末端终止法测序
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Sanger测序技术——双脱氧末端终止法测序
测序pcr反应体系 ddNTPs，dNTPs，Buffer， DNA聚合酶，Template，1 Primer
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四、单分子测序-瀚海基因三代单分子靶向测序技术
单分子全内反射显微成像技术TIRF
图b
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图b Single molecule targeted sequencing for cancer gene mutation detection
四、单分子测序-瀚海基因三代单分子靶向测序技术
虚拟终止碱基
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四、单分子测序-瀚海基因三代单分子靶向测序技术
单分子靶向测序流程
图c
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图c Single molecule targeted sequencing for cancer genemutation
单分子荧光测序是如何工作的？
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测序方法/ 公司/公司 方法/酶
平台
网站
测序长 运行时 正确率（%）成本（美元
转录组测序——UTR鉴定、Intron边界鉴定、Start codon 鉴定、可变剪切研究等；
miRNA测序-miRNA是调控基因表达的一种普遍方式
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五、测序技术的应用——辅助分子育种
育种的核心就是发现或创造遗传变异，通过育种选择出具有优异性状的后代个体；分子育种就是借助分 子生物学的手段，改良物种的遗传物质，发现或创造遗传变异。
病原微生物 病原微生物快速检测
遗传病筛查与诊断 苯丙酮尿症
人乳头状瘤病毒基因检测
先天性甲状腺功能低下症 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(俗
乙肝耐药/分型检测
称蚕豆病) 先天性肾上腺皮质增生症
丙肝分型检测
科研辅助
SNP位点检查——寻找致病基因、诊断及预测致病风险、 药物基因体学及新药的发现（个性化用药）
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三、高通量测序——焦磷酸测序原理
3、测序 将携带DNA的磁珠与其他反应物混合物，放入PTP板中进行测序。 PTP板上含有很多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法固定每个磁珠的位置
以监测接下来的测序反应 测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板，每
Genom, 2011, 12(1): 245.
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五、测序技术的应用——人类健康
生育健康-产前基因检测 胎儿染色体异常无创产前基因检测 孕前基因检测 孕前染色体检测 胚胎植入前染色体异常检测 胚胎植入前单基因遗传病检测
肿瘤分子筛查 遗传性肿瘤基因检测 遗传性乳腺癌基因检测 肿瘤个体化诊疗基因检测 肺癌个体化诊疗基因检测 乳腺癌个体化诊疗基因检测
瀚海基因的“虚拟终止碱基”技术为合成测序过程提 供更高的保真度和反应效率。这种类碱基在单个位置 同时连接了终止结构和荧光标记，具有更加接近天然 的酶反应活性位点。通过可精确单步控制的碱基延伸、 合成终止、荧光激发过程之后，仅需一步切除，即可 去除碱基修饰，允许下一轮的延伸和测序
单分子碱基识别 DirectCall是专门为单分子荧光测序定制的碱基 识别算法，能够精确的检测、定位、配准和识别 单个碱基信号。DirectCall不仅避免了传统二代 测序中相位不一致和GC偏好的顽疾，并且在现有 的单分子测序领域可实现目前最高的测序准确率。