活性氧（ROS）在许多致病过程中起关键作用，包括致癌作用、炎症、缺血再灌注损伤和信号转导。

目前开发的几种方法包括电子自旋共振法和化学荧光法。

其中，荧光检测在高灵敏度和实验方便性方面是优越的。

细胞溶质Ca2+的荧光指示剂，极大地促进了细胞中Ca2+依赖性信号转导的实验研究。

然而，几种用于检测ROS的荧光探针（包括2,7-二氢二氢荧光素（DCFH））可与各种ROS（超氧化物，过氧化氢等等）发生反应。

此外，DCFH易于自氧化，导致暴露在光下时荧光自发增加。

因此，将这些探针视为检测细胞中特定的氧化物质（例如过氧化氢）是不合适的。

胞内羟基自由基测定机理：
2-[6-(4-羟基)苯氧基-3H-黄嘌呤-3-酮基-9-基]苯甲酸（HPF）被设计并合成为新型荧光探针，用于检测选择性高活性氧（hROS），即羟基。

这种新开发的ROS指示剂HPF比二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）具有更高的特异性和稳定性，因此被广泛用于更精确的胞内ROS 定性测量。

尽管HPF本身几乎不发荧光，但HPF选择性地和剂量依赖性地在与hROS反应时产生强荧光化合物，但不与其他活性氧物质（ROS）反应。

因此，通过单独使用HPF，可以将hROS 与过氧化氢，一氧化氮和超氧化物区分开来。

此外，HPF对光诱导的自动氧化具有抗性。

胞内羟基自由基测定方法：
在本研究中，用PBS洗涤500 μL藻类培养物，并在黑暗条件和室温下于10 μM HPF （Invitrogen，美国）的终浓度下温育40 min。

用PBS洗涤一次后，通过FL1通道检测胞内羟基自由基水平。

胞内超氧阴离子自由基测定机理：
一种名为二氢乙锭（DHE）的荧光素被广泛用于测量细胞内超氧阴离子自由基。

DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。

根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化，二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪可直接观察。

胞内超氧阴离子自由基测定方法：
在本研究中，用PBS洗涤1 mL藻类培养物，并在黑暗条件和室温下于20 μM DHE（Invitrogen，美国）的终浓度下温育30 min。

用PBS洗涤一次后，通过FL2通道检测胞内超氧阴离子自由基水平。