装入样品
进样 采样环
进色谱柱
泵入溶剂 出口
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3. 色谱柱 1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。 柱长多为10~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内 径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：
恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积 大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充 物）变化而变化，现已较少使用。
恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机 械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100 次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉 动阻尼器)。
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马达
密封
往复式拉动
机械往复柱塞泵示意图
到色谱柱 脉动阻 尼器 球阀
溶剂
4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成或极性（从而改变分 配比k值）的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上 的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各 自的流量，在高压下混合。
按照固定相不同可分为：液-液分配色谱；吸附色谱(液-固色谱)； 离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、 平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm 的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径
多在150~200m范围内。即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时
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2. 进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。
即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及 检测器的死体积。进样装置包括两种。 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重 现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样 准确，重复性好，如图。
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
凝胶渗透
尺寸排阻
凝胶过滤
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8.2 HPLC仪器 HPLC仪器包括：
1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此外还配有梯度淋洗、 自动进样和数据处理装置。
填充方法： 填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然
后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充 速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。
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4. 检测器
液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、
示差折光和安培检测器、电导检测器等。
1）紫外检测器
其检测原理通常其光程
为2-10mm, 体积约为1~10 L。
其工作过程如图所示。
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He
HPLC仪器详解
出口检查
储液瓶 分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查
抽气
到检测器
分离柱
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压力计
反压调节
注样阀
过滤器
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1. 高压输液系统（150～350×105 Pa） 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔径约2 m，可防止 颗粒物进入泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分 子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。 3）高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。 输液泵种类：恒压型和恒流型。
结202论0年：9月从28日色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前3途！
3. 应用
由于HPLC分离分析的高灵
敏度、定量的准确性、适于非
挥发性和热不稳定组分的分析，
因此，在工业、科学研究，尤
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板
高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效
的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！
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1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需 数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而 柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。 2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些 物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定 或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起 运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混 合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并 与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通 过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
第8章 高效液相色谱
8.1 概述 8.2 HPLC仪器
包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统 8.3 流动相和固定相简介 8.4 高效液相色谱方法简述
分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱
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8.1 概述 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。