4) 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 5) 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选
克 隆 示 意 图
克隆示意图
1. 用限制性酶消化 DNA 样品
粘性末端
2.用 限制 性内 切酶 消化 质粒
DNA
3.连接样品DNA和质粒DNA的 消化产物
冷循环器
4.用连接产物转化大肠杆菌感 受态细胞
转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以
促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进
DNA 吸收。
用氯化钙化学转化
用氯化钙化学转化
电激转化
一个电激转化程序
加 50-200ng DNA 到 40ul 电激感受态细 菌中
将混合物放入一个预冷的电激杯中 施以脉冲电处理，脉冲长度预期值为 8
to 12ms 立即加1ml LB 培养液，在室温下振荡
含有CAP （代谢物活化蛋白）结合位点, 启动子Plac, lac 阻遏蛋白结合位点 编码beta-半乳糖苷酶N-端的多肽的 lacZ基因的5‘端(来自 M13mp18/19).。这个多肽片段的 合成可受IPTG诱导， 与突变菌(mutation lacZDM15)实 现 alfa互补。
pUC18和 pUC19
pBR322
pBR322
pBR322是4362bp的环状 双链DNA载体，有2个抗 药性基因（四环素和氨 苄青霉素），一个复制 起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失 抗药性基因的大肠杆菌 被pBR322成功地转化时， 它便从该质粒获得了抗 生素抗性。两个抗生素 基因中均含供插入外源 DNA用的不同的单一酶切 位点。一般只选一个抗 生素基因作为插入外源 DNA之用。外源DNA插入 后该抗生素抗性失活。 另一抗生素抗性基因则 作为转化细菌后筛选阳 性克隆之用。
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
2-4 小时。 分别取10ul 和 100ul 涂布在到两个加有 抗菌素的LB 琼脂平板上， 保温培养1天。
5. 细菌在加有Amp+X-Gal的培 养基上生长以进行筛选
连接会有三种结果，一是要插入的序 列自连；二是切开的质粒重连；三是 要插入的序列与质粒相连。第一种连 接结果没有菌落形成。第二种连接结 果表现为蓝色菌落。只有后一种结果 是符合需要的，产生白色的抗氨苄青 霉素菌落。
植保生物技术讲座05
第五讲 分子克隆技术
克隆载体
是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的 序列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细 胞)。 其共性有四点：
1. 启动自发复制的能力.
2. 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择。
3. 唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA
4. 非必需DNA序列 尽可能少以克隆更大片段。
阻遏蛋白结合位点和 lacZ基因的 5’-端 序列(lacZ基因的第6-7个密码子被多克隆
位点取代)。
M13mp18/19结构图
多克隆位点
Lambda噬菌体
Lambda噬菌体是一种大肠杆菌的温和性噬菌体。 其 DNA 是线状的、双链的 (48502 nt)，两端的 5’-端有12 个碱基是单链的，碱基互补的。噬 菌体DNA注射到菌体内后末端碱基互补而环化。 在裂菌循环途径，噬菌体编码复制、溶菌和衣 壳蛋白的基因表达。噬菌体DNA复制，复制品 被切下来，包装到子代噬菌体粒体中。在溶原 循环中，噬菌体基因的表达受到遏制，其DNA 通过重组插入到细菌染色体中。
四个重要位点
(1) 负责质粒复制的rep复制子 (来自 pMB1; (2) 编码Rop 蛋白的rop基因，促进 不稳定的 RNA I – RNA II 复合体转变为 稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的 作用 (来自 pMB1); (3) 编码 beta-内酰胺 酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 Tn3转座子); (4) 编码四环素抗性蛋 白的tet基因 (来自 pSC101).
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
灭 菌 器
加IPTG和X-GAL
倒平板
划 线
筛选结果
蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表 达出由完好的α LacZ序列编码的功能 性的 α 片段
白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉 素菌，质粒上α LacZ序列上有插入片 段重 组 Nhomakorabea体 筛 选
筛选结果模式图
蓝 菌 落
蓝菌落
蓝 白 菌 落
蓝白菌落
蓝白菌落
乳糖和诱导物IPTG的化学结构
isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside
X-gal
X-gal水解
实验室
实验室
移液枪
不同规格的小离心管
2ml
1.5ml
0.5ml
吸 取
使用移液枪
使 用 移 液 枪
电泳仪
(1) f1 (IG) –噬菌体 f1的基因间区; (2) rep (pMB1) –pMB1 的复制子，负责 质粒的复制； (3) bla (ApR) –编码 beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨 苄青霉素的抗性; (4) lacZ基因的 5’端 序列，编码编码beta-半乳糖苷酶 的N-端多肽，有了这个这个多肽片 段，就可以菌落蓝白反应对重组质 粒进行筛选
pBluescript II KS/SK
pBluescript SK
M13mp18 和 M13mp19 载体
单链、雄性专化的DNA丝状M13的衍生 物。两个载体均为 7250 bp 长，其多克隆 位点方向相反 。 在 E.coli 操作元 lac 区 含 CAP 蛋白结合位点、 启动子 Plac、lac
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点