1．非常灵敏： A:较双缩脲法灵敏50~100倍。 B：较280nm紫外吸收法灵敏10~20倍。 C：较茚三酮法灵敏好几倍。 D：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。
2．测定结果较少受到样品混浊度的影响。 3．特异性要高于其他大多数方法。
4．操作相对简单，可以在1~1.5小时内完成。
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• 硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对 氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置 于冷水浴中使用。
• 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面， 清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可 能造成吸收液倒吸。
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二、自动凯氏定氮法
将凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的 一套装置，原理与试剂同前。 ▪ 自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏 装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示 装置。 ▪ 消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红 外线加热装置组合而成的消化炉。
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一、凯氏定氮法（常量）
凯氏定氮法通过测出样品中的总含氮量再乘以 相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样 品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的 结果称为粗蛋白含量。
此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等 也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速， 故多用于生产单位质量控制分析。
质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含
量 40mg 、 50mg 、 60mg 、 70mg 、 80mg 、 90mg 、
100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质
样于8支50ml纳氏比色管中，然后各加入1ml四
氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液（①或②）准确
稀释至50ml，振摇10分钟，静置1小时，取上
• 一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品， 如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨 酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解 完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时， 呈较深绿色。
• 蒸馏装置不能漏气。
• 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢 氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
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蛋白质的快速测定－双缩脲法
• 原理
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方法特点及应用范围
• 灵敏度较低，但操作简单快速，在生物化 学领域中测定蛋白质含量时常用此法。
• 适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉 类等样品的测定。也可定量测定分离纯化 后的蛋白质。
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步骤
• 标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白
应式如下：
K2SO4 + H2SO4 → 2KHSO4 2KHSO4 → K2SO
• 硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系 温度过高，又会引起引起生成的铵盐发 生热分解放出氨而造成损失。
• 除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化 钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸 钾。
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滴定
将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶 液直接滴定至由蓝色变为微红色（用甲基 红－溴甲酚绿混合指示剂）即为终点，同 时作一试剂空白。
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• Page 158 公式
计算
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• 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶 冷却，加入30%过氧化氢2～3ml后再继续消化。
色。反应形成颜色的深浅与蛋白质浓度成
正比。
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Bicinchoninic Acid(BCA)法
• 方法 • 1N．aO蛋H白、C质uS溶O4液、和pH含11.有25的BCBAC钠A试盐剂、一N步a混2C合O3。、 • 2．在37℃保温30min或室温下放置2hr,或60℃保温
30min 。 温 度 的 选 择 取 决 于 灵 敏 度 的 要 求 。 较 高 的温度导致较深的颜色反应。 • 3．在562nm处比色读数，并做空白比较。 • 4.用BSA作标准曲线。
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换算系数 6.25 6.38 5.33 5.56 5.36 5.52 5.17
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在消化反应中,为了加速蛋白质的分解, 缩短消化时间,常加入下列物质
1）硫酸钾:
提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生 成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在 340℃左右,而添加硫酸钾后,可使温度提高至400℃以 上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解, 水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大,故沸点升高,其反
• 如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加。 • 高浓度的胺盐会干扰反应。
• 不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同，例如 明胶的双缩脲反应产生红紫色。
• 如果有高浓度的脂（用醚抽出）或碳水化合物 存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色。
• 此方法不是一个测量绝对值的方法，必须用已 知浓度的蛋白质（如BSA）或经凯氏定氮法校 正。
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操作步骤
消化 准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g， 液体样品10～20ml）→移入凯氏烧瓶→加入研细 的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml→摇匀→ 安装消化装置→于凯氏瓶口放一漏斗→以45°角 斜支于有小孔的石棉网上→用电炉先以小火加热 至内容物全部炭化，泡沫停止后→加大火力保持 瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明→继续加热 微沸30分钟→冷却→ 定容。 加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
利用换算系数可以把氮的百分含量转化成样 品粗蛋白质含量。由于大部分蛋白质含有16% 的氮，所以其换算系数一般为6.25（100/16 = 6.25）。
即：
%N × 6.25 = %蛋白质
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部分食品的蛋白质换算系数*
蛋或肉 牛奶 小麦 玉米 燕麦 大豆 大米
蛋白质含量 16.0 15.7 18.76 17.70 18.66 18.12 19.34
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蒸馏
吸取5mL稀释后的消化液→加入凯氏定 氮仪内→加10mL40%的氢氧化钠→夹好漏斗 夹→冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶内预 先装入10ml4%硼酸溶液及混合指示剂) → 加热蒸馏至氨全部蒸出(由红变蓝后约10分 钟) →将冷凝管下端提离液面→用蒸馏水 冲洗管口→继续蒸馏1分钟→加热。
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优点：
• 该方法比凯氏定氮法费用低，速度快（可在不到 30min的时间内完成），是分析蛋白质最简单的 方法。
• 比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色 偏离。
• 几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应。 • 不包含非多肽或非蛋白质来源的氮。
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缺点：
• 不如福林酚法灵敏，分析时至少需要2~4mg蛋 白质。
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方法特点及应用范围
• 灵敏 • 准确 • 快速 • 样品用量少
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三、微量凯氏定氮法
• 原理及适用范围同常量凯氏定氮法 • 主要仪器：凯氏烧瓶（100mL）；微量凯氏
定氮仪 • 试剂：0.01000mol/L HCl 标准液，其余同常
量法
• Page 160
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三、福林酚（Lowry）法
原理
• 蛋白质与福林酚试剂反应，生成的蓝色复合物。 其中蛋白质中的肽键与碱性铜离子反应形成双缩 脲反应，同时蛋白质中存在的酪氨酸和色氨酸同 磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生颜色，蛋白质浓度与 吸光度有较好的线性关系。
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优点
• 因为福林酚法简单、灵敏，已被广泛应用于蛋 白质的生物化学中。然而，一般不用于测定未 从食品混合物中纯化的蛋白质。
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原理
• 样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催化 剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白 质分解，其中C,H氧化为CO2和H2O， 有机N转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。 加碱蒸馏时氨蒸出，用硼酸吸收后， 再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。
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• 样品制备 • 消化 • 中和、蒸馏 • 滴定 • 计算
层清夜离心5分钟，取离心分离后的透明液于
比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液
调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋
白质的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制
标准曲线。
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• 样品的测定：准确称取用品适量（使得蛋 白质含量在40～110mg之间）于50mL纳氏比 色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色 后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的 A值在标准曲线上即可查得蛋白质mg数，进 而由此求得蛋白质含量。
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优点
• 快速，相对较灵敏（在280nm处需要100ug 或更多的蛋白质，比双缩脲法灵敏数倍）。
• 反应不受硫酸铵和其它缓冲液的干扰。 • 不破坏样品原有的性质，在测定完蛋白质
含量后仍然可用于其它分析。广泛用于层 析柱分离后的蛋白质测定。
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缺点
• 核酸在280nm处也有紫外吸收，纯蛋白质和纯 核酸的280nm/260nm紫外吸收比分别为1.75和 0.5 。 如 果 知 道 280nm/260nm 的 值 ， 就 能 校 正 核酸在280nm处的吸收值。
第八章 蛋白质及氨基酸的测定
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第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein） • C：50-55% N：15-18% O：20-23% • H：6-8% S：0-4% • 微量元素：P、Fe、Zn、Cu 2、基本结构单位：氨基酸 3、蛋白质的变性作用。
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缺点
• 由于下列因素，福林酚法在某些应用中需采用标准曲线进 行校正。
1．反应产生的颜色比双缩脲法更易因蛋白质的种类不同而 发生变化。