确保实验结果可靠。
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核酸实验研究技术进展－1
3) 测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大 致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两者相比在含 量上可能有显著差别，然而序列未知。
优点： 可信度最高。 对于解析鉴定未知核酸分子序列片 段是必需的手段。
缺点：目标片段边缘序列的测定结果有时不准确，在读原初 测序图时要格外小心。
缺点： Dot blotting：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子
外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸
分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核
酸分子的结合，因此将可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结
果。 Northern blotting：对低拷贝mRNA有时检测不出来，容
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核酸实验研究技术进展－1
例子：cDNA microarray （反向 Dot blotting） 检测 SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果
A 永生化食管 上皮细胞
SHEE
判断标准： B/A 2或 0.5为显著性 差异表达
实际情况： B/A＝3.53
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核酸实验研究技术进展－1
例子：
RT-PCR检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果
SM
NGAL 600bp
S: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
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核酸实验研究技术进展－1
确保PCR法实验成功的八个关键点： 关键点1：确保实验方案设计合理。 关键点2：确保引物的特异性充分。 关键点3：确保样本质量合格。 关键点4：确保实验试剂质量。 关键点5：确保实验过程规范。 关键点6：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。 关键点7：对于编码序列cDNA，要确保没有RNA的干扰。 关键点8：几种PCR法，或PCR法与其它方法联合使用，相互印证，
化学发光法
NGAL
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例三：
Northern blotting 检测缺 氧复氧条件下心 肌细胞EGR1基 因转录mRNA 实 验结果
同位素法 EGR1
核酸实验研究技术进展－1
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核酸实验研究技术进展－1
确保杂交法实验成功的八个关键点： 关键点1：确保实验方案设计合理。 关键点2：确保探针的特异性充分。 关键点3：确保检测的灵敏度足够高。 关键点4：确保样本质量合格。 关键点5：确保实验试剂质量合格。 关键点6：确保实验过程规范。 关键点7：对于编码序列的cDNA，要确保没有RNA的干扰。 关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证，
上，针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。 Southern blotting：在电泳后，针对目标DNA分子的杂交检测。 Northern blotting：在电泳后，针对目标RNA分子的杂交检测。 目标DNA分子原位杂交检测。 目标RNA分子原位杂交检测。
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核酸实验研究技术进展－1
易导致假阴性结果。
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例一： cDNA microarray 检测SHEEC食管 癌细胞NGAL基因 mRNA转录实验 结果
反向 Dot blotting
核酸实验研究技术进展－1
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例二：
Northern blotting检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL基因 转录mRNA实验 结果
核酸实验研究技术进展－1
B 食管癌细胞
SHEEC
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核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 RT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验 标本中目标mRNA分子或目标cDNA分子的含量
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核酸实验研究技术进展－1
例子：RT-PCR 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果
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核酸实验研究技术进展－1
目标片段边缘序列的测定结果有时不准确例子13核酸实验Fra bibliotek究技术进展－1
Poly A tail
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核酸实验研究技术进展－1
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测定实验标本中目标核酸分子的含量
核酸实验研究技术进展－1
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核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 Dot blotting，结合斑点光密度扫描分析， 测定实验标本中目标mRNA分子、目标cDNA分子或 目标DNA分子的含量
杂交法的优点与缺点：
优点： Dot blotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。
Northern blotting：如果检测结果阳性，其可信度要远远高于
RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的Golden Marker。
Southern blotting：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强。
确保实验结果可靠。
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核酸实验研究技术进展－1
2) PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。 优点： 实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统
中所存在的1个拷贝目标核酸分子。 阴性结果的可信度很 高。 缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验 过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实， 因此，其阳性结果的可信度不如Northern boltting 或 Southern boltting。
ABM
ABM
NGAL 600bp
GAPDH 226bp
A: 永生化食管上皮细胞SHEE B: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
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两个问题： 反转录PCR实验是否需要探针 ？ 反转录PCR的特异性如何保证 ？
核酸实验研究技术进展－1
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核酸实验研究技术进展－1
➢ 通过 Northern blotting，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标mRNA分子的含量
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核酸实验研究技术进展－1
例一：Northern blotting 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果（化学发光）
39-硕士研究生课-现代分 子生物学-核酸研究进展-
1-李恩民
核酸实验研究技术进展－1
证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法： 1）杂交法，2）PCR法，3）测序法。
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核酸实验研究技术进展－1
1) 杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。 Dot blotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体