Sample Flow
硬件系统——光学系统原理
激发和收集光信号
激发 组件
激光器：光源，产生 和发射激发光 透镜和棱镜：将激光 器产生的激发光照到 细胞样品上
收集 组件
滤光片：收集相应波 长的从细胞样本上激 发出的光 收集器： 光电倍增管（PMT）
Guava独特的光学系统——双激光共线性
以Guava easyCyte 8HT为例
FL3
软件系统
仪器清洗、维护，数据获取和分析
Muse独特的人机对话方式——触摸屏

MUSE 独特全触屏式控制系统加强操作的简便性 五步触控即完成细胞分析
开机
调整设置
导入样本信 息
获取数据
输出结果!
Overview of Flow Cytometer
Agenda
• Flow Cytometry Introduction • Tips in Flow Cytometry
• FMO
(Fluorescence-minus-one controls)
Step 3：染色流程
临床样本 加入50 µL样本 科研样本 样本+表面抗原抗体
加入20ul mAb 涡旋振荡, 避光孵育15 min 加450ul BDFACS 溶血素
固定 穿膜 胞内抗体
涡旋振荡, 孵育15 min 信号采集和分析
复合染料容易降解 降解因素包括：光照、 甲醛固定剂、温度升高 选择专用固定剂、 APC-H7 批次差异大 不同批次补偿不同
B. Without CD8 APC-Cy7:
Step 2：试剂选择
抗体的选择：
单克隆抗体 直接标记的抗体 特异性克隆 混合性克隆
抗体来源
根据对神经氨酸酶及糖蛋白酶的敏感性不同，CD34 抗体可分为3 类: ① Ⅰ类抗体,这类抗体对上 述两种酶均敏感,需要与CD34 分子的糖类部分及末端唾液酸结合,然而这种结构只存在于部分CD34 的分子中,因此会造成结果不同; ② Ⅱ类抗体,此类抗体只对糖蛋白酶敏感; ③ Ⅲ类抗体,此类抗体对 两种酶均不敏感。Ⅱ类抗体与FITC 结合时会产生静电而影响结合特性,因此目前多采用Ⅲ类抗体 如抗HPCA22 (BDIS) , 581 ( Coulter2Immunotech ) 和Birma2k3 (DAKO)
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物 粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个 细胞中测得多个参数。
检测样本： 外周血，骨髓，穿刺液，洗脱液，尿液，唾液，实 体组织，培养细胞，微生物，微球、血清、细胞裂 解液等 提供的信息： 相对细胞大小(FSC) 相对细胞颗粒密度和内部复杂度(SSC) 染色过细胞的相对荧光强度(Fluorescence)
Step 1：样品准备
方法一：溶血法 1. 取100 ul抗凝全血； 2. 快速加入2mlNH4CL溶血剂,混匀； 3. 室温孵育10分钟； 4. 4ºC，300g离心10分钟。去上清，加入1mlPBS； 5. 4ºC，300g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。 溶血素：NH4Cl，草酸 优点：方便，简单，不容易丢失细胞 缺点：细胞形态变化大，荧光背景比较高,影响表面抗原
Step 2：试剂选择
荧光素的选择：
• 根据仪器的配置选择荧光素（488，633，405，375） • 根据抗原表达的强度选择荧光的亮度
• 最小化荧光重叠（FITC、PE）
• 谨慎选择复合荧光染料（PE-cy5、PE-cy7） • 对于荧光背景高的细胞群体的染色，尽量选择红激光激发的染料
Step 2：试剂选择 “Bright” = good resolution sensitivity
洗涤 信号采集和分析
Step 4：仪器质控
Guava Check Beads Daily QC of system performance Levy-Jennings graphs automatically calculated
Step 5：数据获取与分析
• • 空白组：调节PMT电压； 单染组：调节补偿；
• • • • • • •
• ……………
Step 5：数据获取与分析
单染组：调节补偿；
Step 5：数据获取与分析
单染组：调节补偿；
Compensation at 110% Compensation at 15%
Step 5：数据获取与分析
单染组：调节补偿；
Step 5：数据分析
• • • • 画图 设门，设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数 或抗体结合数
Reagent PE Alexa 647 APC PE-Cy7 PE-Cy5 PerCP-Cy5.5 PE-Alexa 610 Alexa 488 FITC PerCP Filter 585/40 660/20 660/20 780/60 695/40 695/40 610/20 530/30 530/30 695/40 Stain Index 356.3 313.1 279.2 278.5 222.1 92.7 80.4 75.4 68.9 64.4
Epigenome
Transcript
Transcriptome
Protein
Proteome
Strength in integrity
Cytology
Cell
What is Flow Cytometry? Flow Cyto Metry
FluidCell NhomakorabeaMeasurement
What is Flow Cytometry?
•
•
阴性对照组：设定界限；
收取足够的细胞数
Tube1: cells+A*-FITC,B*-PE,C*-PerCP
Step 5：数据获取与分析
单染组：调节补偿；
试剂：A-FITC,B-PE,C-PerCP;A*-FITC,B*-PE,C*-PerCP Tube1: cells+A*-FITC,B*-PE,C*-PerCP Tube2: cells+A-FITC,B*-PE,C*-PerCP Tube3: cells+A*-FITC,B-PE,C*-PerCP Tube4: cells+A*-FITC,B*-PE,C-PerCP Tube5: cells+A-FITC,B-PE,C-PerCP Tube6: cells+A-FITC,B-PE,C-PerCP
Step 1：样品准备
方法二：密度离心法提取单个核细胞 常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚 体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出 正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管 底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液 的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可 从外周血中分离到单个核细胞。
优点：干净，荧光背景比较低 缺点：容易丢失细胞，操作麻烦
Step 1：样品准备
方法三：贴壁细胞或实体组织处理 Enzymatic digestion : trypsin, collogenase, pronase. Chelating agents - removal of ‘binding’ ions : EDTA, EGTA, TPB. Mechanical : teasing, sieving, aspiration (syringing) and sonication. 要求：单细胞悬液（适当降低浓度）
谨慎选择复合染料
A. With CD8 APC-Cy7 and CD4 PE-Cy7:
Gating scheme CD8 APC-Cy7+ cells CD4 PE-Cy7+ cells


False positives in APC channel reduced in absence of APC-Cy7 False positives in PE channel remain
APC-Cy7
Alexa 700 Pacific Blue AmCyan
7801/60
720/45 440/40 525/50
42.2
39.9 22.5 20.2
Step 2：试剂选择 “Min Spillover” = good resolution sensitivity
Step 2：试剂选择
Step 1：样品准备 Step 2：试剂选择 Step 3：染色流程 Step 4：仪器质控 Step 5：数据采集与分析
The Conversion of Reseach Focus Why more people focus on flow cytometry?
Gene
Genome
DNA Methylation
流式细胞术实用技巧
Sukie Gong Imaging Field Application Scientist– Instrument Platform, Bioscience
26 June, 2015, Wuhan
Agenda
• Flow Cytometry Introduction • Tips in Flow Cytometry
流式细胞仪的基本组成
硬件系统
液流系统 光学系统 电子器件
软件系统
硬件系统——液流系统原理
将样本悬液聚焦在光源的中心处