可参考的药效学实验模型： (1)治疗心肌缺血实验：垂体后叶致大鼠心肌缺血实验、小 鼠耐缺氧实验； (2)解热、镇痛实验：角叉菜胶或细菌内毒素解热实验、小 鼠扭体实验； (3)止咳平喘实验：氨水刺激实验、离体豚鼠气管实验； (4)抗炎解毒实验：小鼠耳肿胀实验、毛细血管通透性实验、 抑菌实验； (5)活血化瘀实验：血小板聚集实验、耳廓微循环实验。
重复是指在相同实验条件下进行多次研究或多次观察。 重复原则包括两个含义：①是实验必须有足够的样本数或例数，在一 次实验中有充分的重复；②是要使实验结果可靠，必须多次重复实验。 也就是说，实验要有一定的次数。
基本原则
2. 体现中医的特点
鼓励应用生物活性测定方法探索中药质量控制， 拟建立的方法的测定指标应与该中药的“功能与 主治”相一致。
研发室 林 兵
2016.07
前言 基本原则
基本内容
方法学验证
前言
中药特点
成分复 杂多变
药效成分 不明确
活性成 分 多
毒性成分 不明确
给质量控制带来了很大的挑战！
现代分析手段的大量应用 中药质量控制水平有了巨大的飞跃
尽管中药质量控制水平发展很快,但仍存在一些共性问题:
含量高、容易控制的成分未必是药效成分 含量过低的药效成分又不能保证与临床有效剂量之间的关联性
指在科学研究中，使用较少量的动物获取同样多的试验数据或使用一定数量的 地动物能获得更多实验数据的科学方法。
Replacement（替代）
指使用其他方法而不用动物所进行的试验，以达到某一试验目的。或是使用没有 知觉的试验材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎动物进行试验
基本内容
基本内容
3. 结果与统计
生物效价测定法：应符合生物检定统计法（通则1431）的要求， 根据样品测定结果的变异性决定效价范围和可信限率（FL％） 限值； 生物活性限值测定法：应对误差控制进行说明，明确试验成立 的判定依据，对结果进行定量和/或定性统计学分析，并说明 具体的统计方法和选择依据。

4. 判断标准
量效关系考察：取金纳多注射液，用0.9％的生理盐水分别配制成梯度为 85％、72％、61％、52％、44％的样品液各1 mL，作为对照品。取舒血 宁注射液1支，用0.9％的生理盐水分别配制成梯度为85％、72％、61％、 52％、44％的样品液各1 mL，为供试品。按实验方法分别测定含药血浆 的血小板最大聚集率。 效价测定及可靠性考察：取金纳多注射液，同法配置成含注射液100％(原 液)、85%、72%的稀释液，作为对照品组(S)；取舒血宁注射液，同法配 置成含注射液100％(原液)、85%、72%的稀释液，作为供试品组(T)。

模型选择：血小板聚集抑制模型 动 物：家兔 供试品： 舒血宁注射液(5 mL/支) 两者原料均为银杏叶提取物 对照品：金纳多注射液(5mL/支) 试验方法：家兔颈总动脉放血75 mL，加3.8％枸橼酸纳(1:9)抗凝，1 000 r/min
离心10 min制备富血小板血浆(PRP)，剩余血样继续3 500 r/min离心10 min制备 贫血小板血浆(PPP)。用血液分析仪测定PPP和PRP中的血小板数，利用PPP调节 PRP中的血小板数在4.0～4.5×1012个/L之间。 取PPP 210 μL加入测试杯，进行仪器调零。再取PRP 80 μL ，分别加入不同 质量分数的样品液20 μL ，37℃孵育180 s，分别加入聚集诱导剂（ADP、PAF） 10 μL ，测定5 min内的最大聚集率。
Randomization Control
重 复
Replication
具备简单、精确的特点，应有明确的判断标准
分组或抽样时指按照机遇的原则进行，使各受试对象被分配到各组的 机会均等，而不受主观因素的影响。 随机化的方法有抽签法、抛硬币法、随机数字表等。 设置对照，排除非实验因素的影响，消除实验误差，保证实验结果的 可比性和实验结论的正确性。 正常对照、模型对照、阳性对照、溶剂对照。
按照S1、Tl、T2、S2、S3、T3的顺序(排除因S组和T组测定的先后次序引 起的误差)，平行测定3次。按《中国药典》生物检定统计法中量反应平行 线三三法进行统计学处理，考察结果的可靠性，计算T组的效价(PT)和可 信限率(FL％)。
效价测定结果：由于金纳多注射液在药典中尚无效价的规定，因此假设 对照品(s)金纳多注射液的效价为100 u/mL，由于舒血宁注射液与金纳多 注射液成分相同，且基本成分的含有量也相同，如果舒血宁注射液抑制 血小板聚集的效果与金纳多相同，则其测得效价也应为100 u/mL，结果 见表1。
表2 舒血宁注射液由ADP诱导效价测定的可靠性检 验结果 表3 舒血宁注射液由PAF诱导效价测定的可靠性检 验结果
郭玉东，等. 舒血宁注射液体外抑制血小板聚集的生物活性测定法[J]. 中成药，2014,36(5):1008-1012.
前言
2010版《中国药典》修订时增加了 《中药生物活性测定指导原则》
2010版 药典 一部 附录 XⅧ C 中药生物活性测定指导原则
2015版药典修订时将上版药典附录整合 为通则，并与药用辅料单独成卷作为四部
9000 指导原则 9105 中药生物活性测定指导原则
前言
生物活性测定法：是以药物的生物效应为基础，以生物统计 为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法， 从而达到控制药品质量的作用。 中药

方法学验证
1. 测定方法影响因素考察
应考察测定方法的各种影响因素，通过考察确定最佳的试验条件， 以保证试验方法的专属性和准确性。根据对影响因素考察结果，规定方 法的误差控制限值或对统计有效性进行说明。
2. 精密度考察

重复性 中间精密度
按确定的测定方法，用3批供试品、每批3次或同批供试品进行6次测定试验后对 结果进行评价。生物活性测定试验结果判断应基本一致。 考察实验室内部条件改变（如不同人员、不同仪器、不同工作日和实验时间） 对测定结果的影响，至少应对同实验室改变人员进行考察。 生物活性测定试验结果必须在3家以上实验室能够重现。
小鼠
近交系：BALB/c、C57BL; 远交系：KM、ICR小鼠；突变系：裸鼠
适用于需大量动物的实验，如某些药物的筛选，半数致 死量的测定。也较适用于避孕、抗炎镇痛、中枢神经系 统、抗肿瘤及抗衰老等药物的实验。
大鼠
SD、Wistar大鼠
比较适用于抗炎、血压测定、利胆、利尿等药物实验，也 可用于进行亚急性和慢性毒性实验。 豚鼠 因其对组胺敏感，并易于致敏，故常用于抗过敏、平喘和 抗组胺等药物实验。又因它对结核敏感，也用于抗结核病 药的实验。
基本内容
供试品选择 应选择工艺稳定，质量合格的供试品。若为饮片，应基 源清楚。应至少使用三批供试品 标准品或对照品

生物效价测定法：首选中药标准品，也可以考虑化学药 作为标准品 生物活性限值测定法：可采用中药成分或化学药品作为 方法可靠性验证用对照品。
采用标准品或对照品均应有理论依据和/或实验依据。 国家标准中采用的标准品或对照品的使用应符合国家有关 规定要求。
基本内容
剂量设计


其

生物效价测定法：供试品和标准品均采用多剂量组试验， 并按生物检定的要求进行合理的剂量设计，使不同剂量 之间的生物效应有显著性差异； 生物活性限值测定法：建议只设一个限值剂量，限值剂 量应以产生生物效应为宜； 他
给药途径：一般应与临床用药途径一致。如采用不同的 给药途径，应说明理由。 给药次数：根据药效学研究合理设计给药次数，可采用 多次或单次给药。 指标选择：应客观、明确，与“功能主治”基本一致。


重现性
3. 方法适用性考察
按拟采用的生物活性测定方法和剂量对10批以上该产品进行测定， 以积累数据，考察质量标准中该测定项目的适用性。
例：舒血宁注射液体外抑制血小板聚集的生物活性测定法
药材选择：舒血宁注射液
功能主治：扩张血管，改善微循环。 方 法：生物效价测定法
※中药注射液※ ※功能主治明确※
基本内容
实验动物
如采用实验动物，尽可能使用小鼠和大鼠等来源多，成 本低的实验动物，并说明其种属、品系、性别和年龄。 应遵循3R原则： “优化、减少、替代”
Refinement & Reduction & Replacement
Refinement（优化）
通过改进条件，善待动物，提高动物福利，或完善实验程序和改进实验技术，避 免或减轻给动物造成的与实验目的无关的疼痛和紧张不安的科学方法。
表1 舒血宁注射液由ADP、PAF诱导的测得效价与可信限率
可靠性考察结果：表2，表3为两种测定方法的可靠性检验结果，结果显 示两种诱导剂诱导的血小板聚集可靠性检验均合格，回归显著(P<0.01)， 偏离平行、二次曲线、反向二次曲线均不显著(P>0.05)，可信限率均小 于10％，以上结果表明该方法得到的效价结果可靠。
生物效价测定法：应按品种的效价范围和可信限率（FL％）限值 进行结果判断。 生物活性限值测定法：应在规定的限值剂量下判定结果，初试结 果有统计学意义者，可判定为符合规定；初试结果没有统计学意 义者，可增加样本数进行一次复试，复试时应增设阳性对照组， 复试结果有统计学意义，判定为符合规定，否则为不符合规定。
基本内容
1. 实验条件 实 验 系 括整体动物、离体器官、血清、微生物和组织、细胞、 亚细胞器、受体、离子通道和酶等。 灯盏花素注射液采用整体动物进行生物活性测定 缩宫素采用大鼠离体子宫平滑肌进行生物活性测定 水蛭用凝血酶进行生物活性测定 试验系的选择 应选择背景资料清楚、影响因素少、检测指标灵敏和成 本低廉的试验系统。应尽可能研究各种因素对试验系的 影响，采取必要的措施对影响因素进行控制。
基本原则
3. 品种选择合理