在生物学研究中绿色荧光蛋白具有广泛 用途，包括有
• 1.分子标记
利用绿色荧光的发光机制，可将 GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术， 将目的基因与GFP基因构成融合基 因，转染合适的细胞进行表达，然 后借助荧光显微镜便可对标记的蛋 白质进行细胞内活体观察
2.药物筛选
荧光显微镜的基本结构
滤光片
荧光显微 镜
隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见 波长 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光 透过，保护眼睛。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光路
透射光：照明光线从 标本下经聚光器透过 标本进入物镜。 落射光：照明光线从 标本上经垂直照明器 落射到标本，经标本 反射进入物镜。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点击 数码成像系统软件，采集数码图像。
2.注意事项
(1)因观察荧光使用的光源为高压汞灯，其中发出的光含紫 外光，对人眼有损害作用，故必须安装紫外防护罩。 (2)为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银 蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15分钟后才能关闭。 (3)汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸气 尚未恢复到液态，内阻极小，再次施加电压，会引起短路， 导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电器，更重要的是汞蒸气溢 出，将导致工作室污染。故关闭汞灯之后，不能马上再次 打开，必须等待至少30分钟。
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色 透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不 易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作 封裱剂。 （五）镜油
一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本 时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光 镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可 用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
荧光探针分布是利用信号
传导中信号分子的迁移功能， 将一荧光蛋白与信号分子相偶 联，根据荧光蛋白的分布情况 即可推断信号分子的迁移状况， 并推断该分子在迁移中的功能。 由于GFP分子量小，在活细胞 内可溶且对细胞毒性较小，因 而常用作荧光探针
六、荧光抗体染色
直接法
荧光素标记的特异 性抗体直接与相应 抗原反应。
原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列， 将有放射性或非放射性的外源核酸(即 探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。
课后作业
• 请同学查阅资料，比较荧光原位杂交技术 在实际应用中的优缺点。
technique)”。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出， 从而可对抗原进行细胞定位
• 2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。
绿色荧光蛋白
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)， 简称GFP，其基因所产生的蛋白质，在蓝 色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤 光
透射荧光显微镜光路 (a)
落射荧光显微镜光路(b)
一 . 荧光显微镜的原理
• 某些物质在一定短波长的光 (如紫外光)的照射下吸收光能进 入激发态，从激发态回到基态时, 就能在极短的时间内放射出比照 射光波长更长的光(如见光)，这 种光就称为荧光。
• 荧光显微镜利用特殊的照明装 置发出较短波长的激发光，诱发 荧光物质发出荧光,通过物镜作用 在样品上，在有目镜观察到肉眼 可见的荧光。
荧 光 显 微 镜
四、荧光显微镜的基本结 构
荧光显微镜
利用一定波长的激发光 对样品进行激发，产生一定 波长的荧光，对样品结构或 其组分进行定性、定位、定 量观察检测。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
➢光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 ➢滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 ➢光路：透射光、落射光 ➢聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光 器 ➢镜头：消色差镜头
(4)高压汞灯工作时会散发大量的热量，因此， 工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件。
(5)汞灯的使用寿命约200—300小时，在电源 控制箱上有时间累计计数器，使用者要记录累计 小时数，达到300小时，需更换新灯泡，否则亮 度不够，影响观察
四.荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚 的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能 使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁， 厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石 英玻璃载玻片。
荧光抗体技术的应用
①自身抗体检 测
抗核抗体(均质型)
抗核抗体(斑点 型)
抗核抗体(核膜型)
荧光抗体技术的应用
②病原体检 测
细菌（藤黄微球菌 )
寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）
荧光抗体技术的应用
③免疫病理检 测
肿瘤（人肝癌细胞）
七、荧光原位杂交
概念： 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测 体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸 进行定位和相对定量研究的一种手段。
二.荧光显微镜的结构
主要结构有机械系统和光学系统两部分，如图 1.机械系统：包括底座、镜身、观察筒三部分 2.光学系统: 包括物镜、聚光镜、光源等
三.荧光显微镜的操作及注意事项
• 1．基本操作步骤
(1)安装紫外防护罩。 (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。 (3)插入挡光板，中断光路。 (4)预热5—10分钟。 (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。
五.荧光显微镜应用技术
1. 对细胞结构或组分的定性位、半定量研究
免疫荧光技术
用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的 物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技 术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接， 用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免疫荧 光技术(direct immunofluorescent technique)”。用荧光染 料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合体的方 法则称“间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescent
(6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。
(7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要 的分光镜组件：“O”为观察透射光时 用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如 DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如 FITC)；“WG"为观察红色荧光时用 (如TRITC)。
(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内 置于荧光显微镜)。
直接荧光抗体染色法示意 图
荧素 标记的抗抗体再与 第一抗体结合。
间接荧光抗体染色法示意 图
荧光抗体染色
双标记法
两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗 体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜 色荧光。
荧光抗体染色
荧光抗体染色结果判 断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
（二）盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了 加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一 种特制的表面镀有若干层对不同波长的光 起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖 玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激 发光，这种反射的激发光女可激发标本。
（三）标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激
发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观 察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或 杂质掩盖，影响判断。 （四）封裱剂