要使生长阶段和诱导阶段分开 ,启动子的严格 调控至关重要 ,特别是表达有毒性的毒素蛋白 ,否则 在生长阶段会杀死宿主细胞 。异源的启动子在酵母 中无效 ,只有酵母的启动子才能用于表达外源基因 。 常用的启动子有 GAL1 、GAL7 、GAL5 、AOX1 启动 子 ,可被葡萄糖所抑制和被半乳糖或甲醇所诱导 。 许多选择性标记可用于转化子的筛选 ,包括 HIS4 和抗生素 Zeocin 等 。酵母的转录终止过程近似于 高等真核生物 ,包括转录终止 、内切核苷酸加工 、多 聚腺苷酸化 。
32 生物技术通报 Biotechnology B ulleti n 2002 年第 2 期
3 昆虫细胞表达体系
除了以杆状病毒介导的昆虫细胞表达体系外 , 又开发比较新型的稳定转化系统 ,用于大量制备具 有功能活性的目的蛋白[8 ,9 ] 。其表达水平高于哺乳 动物细胞表达系统 ,并且在表达真核蛋白时 ,可以对 其进行翻译后修饰 ,其优越性远超过细菌表达体系 。 3. 1 杆状病毒和宿主细胞
细菌是一个重要的表达体系 ,特别对于不需糖 基化的蛋白 ,并且表达水平很高 。但由于原核细胞 表达体系简单 ,所以有其局限性 ,只适合少数蛋白 。
2 酵母表达体系
酵母具有微生物和真核生物的双重特点 。与大 肠杆菌不同的是 ,酵母可以对异源蛋白进行修饰 ,当 采用酵母信号肽时 ,蛋白能被正确折叠和加工 ,然后 分泌到培养基中 ;与哺乳动物细胞不同的是 ,酵母可 以在简单培养基中迅速生长 。可用酵母发酵技术对 临床和工业上有用的重要蛋白进行了工业化生产 。 目前抗体及其片段都用该系统进行了表达[4 ] 。它 还可以表达几乎所有植物蛋白 。在大肠杆菌中以包 涵体形式出现的蛋白 ,在酵母中表达时可生成可溶 性蛋白[3 ] ,另外 ,该系统可以克服异源蛋白降解问 题。 2. 1 转录 、转译调控元件
Key words : Expression systems Ecoli Yeast Insect cells Mammalian cells
随着生物化学和分子生物学技术的发展 ,使人 们得以更深入地了解蛋白质分子的一级和二级结 构 ,这样就可以有目的的进行改造 ,创建新的有价值 的蛋白质分子 。为此 ,各种不同的表达体系应运而 生 ,如细菌[1 ] 、昆虫细胞[2 ] 、酵母[3 ] 、哺乳动物细胞 表达系统等 。
2002 年第 2 期 吴丹等 :几种表达系统的比较
31
溶剂和氧还偶的存在 、反应的 p H 值等 。 1. 3 蛋白的分泌
采用前导序列可将蛋白直接分泌到细菌的周质 腔隙中 。常用的前导序列有 pe IB 前导序列 (来自 Erwinia carotocora 的果胶酸盐裂解酶基因) 和衍生 于碱性磷酸酶基因的前导序列 。有时周质中的重组 蛋白通过外膜“渗漏“到培养基中 ,这主要决定于蛋 白的氨基酸序列等 ,而非信号序列[31 ] 。表达产物分 泌到培养基中有利于快速筛选 ,Байду номын сангаас产物产量很高时 , 可以从培养基上清中直接纯化 。如果在上清中没有 发现产物 ,就需要从周质浸出物中分离蛋白 ,通常通 过溶解的方法 。
关键词 : 表达系统 大肠杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞
Comparison of Several Expression Systems
Wu Dan Qiu Huaji Tong Guangzhi
( N ational Key L aboratory of V eteri nary Biotechnology Harbi n V eteri nary Research I nstit ute Chi nese Academy of A gricult ural Sciences , Haerbi n 150001)
1 大肠杆菌表达体系
大肠杆菌 ( E. coli) 表达系统的优点是产量高 、 生长速度快 、操作容易 、成本低 ,其缺点是不能对表 达蛋白进行糖基化修饰 。 1. 1 启动子等元件
为获得成功的表达 ,蛋白编码基因上下游需有 合适的序列 ,确保蛋白有效转录和翻译 。用于控制 蛋白表达的关键元件是启动子 。常用的启动子有 lac 、t rp 启动子或其复合物 ,以及λPL 启动子 。λPL 启动子专司λDNA 分子的转录 , 受温敏阻遏物调 控 。T7 RNA 启动子可用于严格调控的高水平表 达 。原核生物的核糖体结合位点 ( RBS) 是 E. coli 有效转录的第二个重要元件 。它包括起始密码子
Abstract : Wit h t he development of recombinant DNA technology and protiein engineering ,many types of protein t hat havepotential values need to be produced. There are great differences at expresson levels among different protein ex2 pression systems. So it’s critical to choose an appropriate expression system for protein production. This review will sum2 marize t he advantages and disadvantages of bacterial ,yeast , insect and mammalian expression systems ,and also discuss t he solutions to common problems.
在制订外源蛋白分泌表达策略时 ,可利用外源 蛋白的天然信号肽来促成重组蛋白的分泌 ,但有比 较研究表明 ,利用外源蛋白的天然信号肽引导表达 的重组蛋白较易降解 ,而利用酵母蛋白信号肽引导 表达的外源蛋白较为稳定[23 ] 。通常采用 S. cerevisi2 aeα - M F 、Pichia Pastoris PHO 、S. cerevisiae SUC2 的前导序列[24 ] 。酵母表达体系可将蛋白糖基化[6 ] 。 哺乳动物中的糖链由多种糖类组成 ,其中包括 N 乙酰半乳糖胺 、半乳糖 、唾液酸 ,相比之下 ,酵母所加 的糖链仅为甘露糖残基 。 2. 3 新型酵母 Pichia Pastoris
在酵母中 ,5′端非翻译区的二级结构和过高的 G含量可抑制翻译的起始 。起始密码子 A T G 前通
常需要富含 A 的序列 ,如可有效启动翻译的基序 AAAAAAA T G。
该表达体系对于外源基因序列的内在特性要求 严格 ,A + T 的含量在 30～55 % ,密码子的使用也具 有选择性[5 ] 。 2. 2 蛋白的修饰与加工
在典型的杆状病毒载体中 ,外源基因由强大的 多角体启动子所控制 ,以确保基因高水平转录 ,便于 重组病毒的筛选 ,并且可将重组蛋白大量分泌至培 养液中 。常用的杆状病毒是 A utographa calif orni2 ca 多 核 型 多 角 体 病 毒 ( AcN PV ) 和 家 蚕 ( B om by x mori) 多核型多角体病毒 (BmN PV) 。宿主细胞通常 来 源 于 双 翅 目 昆 虫 , 包 括 果 蝇 、蚊 子 。其 中 有 Schnei der 2 和从 D rosophil a mel anogaster 中衍生的 Kc 。来源于 S podoptera f rugi perda 的 Sf9 细胞系 是最常用的宿主细胞[10 ] 。 3. 2 翻译后的修饰 、加工
酵母表达量很高 ,特别是新型酵母 Pichia Pas2 toris 的产量可达 100～250mg/ L [7 ] 。破伤风毒素片 段 C 的表达量达到 12g/ L [25 ] 。酵母可进行高密度 发酵培养 ,在发酵罐中细胞干重可达 120g/ L 。兔抗 人的白血病抑制因子抗体在 Pichia Pastoris 中表达 量比在 E. coli 中增加 100 倍 。Pichia Pastoris 分泌 的某些蛋白有多糖基化现象 , 如 HIVgp120[26 ,27 ] 。 目前 , 对 于 糖 链 的 添 加 机 制 还 知 之 甚 少 。Pichia Pastoris 发酵培养产量高 , 但也有不尽人意之处 。 目的蛋白产量增加的同时 ,也提高了其它细胞分泌 的浓度 ,特别是蛋白水解酶 。在此环境下 ,有些蛋白 稳定 ,而另一些蛋白则特别容易被降解 。通常采用 三种方法解决 : (1) 补加氨基酸丰富的培养基 ,如蛋 白胨或酪蛋白氨基酸 ,使其作为蛋白水解酶的底物 , 以减少表达产物的降解[28 ] 。(2) 改变培养基的 p H 值[16 ] ,Pichia Pastoris 可在 p H3～7 的范围内生长 , 可将 p H 值调至蛋白水解酶活性区间之外 。例如表 达γαNA GAL 时就是通过维持 p H5. 5 使产物保持 稳定 ,而表达 mEGF 时则是通过维持 p H6. 0 和添加 1 %酪氨酸蛋白水解物以增加产量 。(3) 使用蛋白水 解 酶 基 因 缺 陷 的 Pichia Pastoris 宿 主 菌 (SMD1168) ,如在表达乳糖酶时 ,使用 SMD1168 较 之正常受体菌 GS115 表达量提高 2 倍[29 ] 。
生物技术通报
·综述与专论· B IO T EC HNOL O G Y BUL L ETIN 2002 年第 2 期
几种表达系统的比较
吴丹 仇华吉 童光志
(中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室 ,哈尔滨 150001)
摘 要 : 随着蛋白质工程和 DNA 重组技术的发展 ,许多有应用潜力的蛋白分子有待开发 。不同蛋白在不同 系统中表达水平有显著差异 ,所以选择一种合适的表达系统对蛋白表达水平非常关键 。对细菌 、酵母 、昆虫杆状病 毒 、哺乳动物细胞 4 种表达体系作一概述 ,并讨论各自优缺点及常见问题 。
A T G 和 SD 序列 ,其在 SD 序列的位置和大小影响 蛋白翻译效率 。SD 序列由 3～9 核苷酸组成 ,位于 起始密码子上游 3～11 核苷酸处 。另一个重要调控 元件是转录终止子 ,它可以防止转录超出目的基因 , 并增加 DNA 分子稳定性 。 1. 2 蛋白的加工