专题1 基因工程※基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。

﹡原理：基因重组﹡目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

﹡意义：能够打破生物种属的界限（即打破生殖隔离，克服远源杂交不亲和的障碍），在分子水平上定向改变生物的遗传特性。

﹡操作水平：DNA分子水平【思考】：（1）基因工程的物质基础是：所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。

（2）基因工程的结构基础是：所有生物的DNA均为双螺旋结构。

（3）一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达，是因为它们共用一套遗传密码子。

一、基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端（回文结构特点）。

①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。

②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。

2.“分子缝合针”——DNA连接酶（1）分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类（2）功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。

(3)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。

DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

（4）与DNA分子相关的酶3.“分子运输车”——载体（1）作用：①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。

（2）载体具备的条件：①能在受体细胞中自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。

②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

④大小合适，对受体细胞无害。

（3）最常用的载体是质粒。

它常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

（4）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒4 DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。

二、基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因是指：主要是指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。

※基因的结构：基因是有遗传效应的DNA片段(注：RNA病毒为RNA)，分为编码区和非编码区。

编码区：能转录出mRNA，原核生物中也就是能编码蛋白质的区段非编码区：不能转录出mRNA，也不能编码蛋白质的区段※原核细胞的基因结构与真核细胞的基因结构的异同点真核细胞基因结构要比原核细胞的基因结构复杂，编码区间隔的、不连续，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式，分为：外显子：能够编码蛋白质的序列；内含子：不能够编码蛋白质的序列（１）原核细胞基因的结构非编码区中存在调控遗传信息表达的核苷酸序列:①编码区上游的RNA聚合酶结合位点，即启动子，可控制RNA聚合酶的结合。

RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并结合调控序列中的结合位点，能催化DNA转录为RNA②编码区下游有终止子，可控制RNA聚合酶的停止、脱落。

（2）真核细胞基因的结构(调控序列)2.获目的基因的来源：从自然界中已有的物种中分离及人工合成。

3.目的基因的获取方法：（1）从基因文库中获取（基因组文库、cDNA文库）※基本概念的理解：①将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

②将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后将这些片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。

这个群体包含了这种生物的所有基因。

这种基因文库叫基因组文库。

③有些基因文库比较小，只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，如cDNA 文库（用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体叫做这种生物cDNA文库。

）﹡基因组文库和部分基因文库的比较：文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间基因交流可以部分基因可以（2）用化学方法直接人工合成①反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。

目的基因转录成的mRNA单链DNA 双链DNA（目的基因）②根据已知的氨基酸序列合成DNA法:蛋白质中氨基酸的序列mRNA中的碱基序列DNA碱基序列目的基因目的基因（3）用PCR技术扩增目的基因原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。

人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

※ PCR技术扩增目的基因（1）PCR是聚合酶链性反应的缩写，发明人：穆里斯等人（2）原理：DNA双链复制（3）实质：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

（4）前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物。

（5）条件：a..四种脱氧核苷酸b.DNA的两条链为模板c.热稳定DNA聚合酶(T aq酶）d.一对引物（一小段单链DNA或RNA，一般20～30个碱基，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对）e.温度控制和缓冲液（6）过程：第一步：（变性）加热至90～95℃，DNA解链；双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 第二步：（复性）冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链第三步：（延伸）加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

在T aq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链（7）特点：指数形式扩增﹡PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、酶等不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子第二步：基因表达载体的构建（核心）1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。

（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

常用的标记基因是抗生素基因。

3. 条件：同种限制酶、DNA连接酶、ATP（目的基因、启动子、终止子、标记基因）4. 构建步骤：用同一种限制酶切割目的基因和载体，从而产生相同的黏性末端，再用DNA连接酶连接。

（形成的分子称：重组DNA分子或重组质粒。

）第三步：将目的基因导入受体细胞_1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.将目的基因导入受体细胞：⑴常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。

⑵将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。

3.常用的转化方法：（1）将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。

﹡农杆菌转化法①特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。

（2）将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。

此方法的受体细胞多是受精卵（也可以是卵细胞）。

（3）将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

※感受态细胞：大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用用钙离子处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称感受态细胞。

﹡总结：受体细胞的种类●植物：可以是受精卵、体细胞（可经组织培养成完整个体）●动物：受精卵（因为动物细胞的全能性受到抑制）4.转化的实质：目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。

5.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

第四步：目的基因的检测和表达1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。

基因探针：是指用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。

3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。

4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定，对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。

例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。

重组的DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。

例如，科学家最初做抗虫棉试验时，虽然已经检测出棉的植株中含有抗虫的基因，但让棉铃虫食用棉的叶片时，棉铃虫并没有被杀死，这说明抗虫基因还不能在高等植物中表达。

科学家在研究的基础上，又一次对棉植株中的抗虫基因进行了修饰，然后再让棉铃虫食用棉的叶片，结果食用的第二天棉铃虫就中毒死亡了。