染色方法
– 将准备好的试材浸泡在染液，于25—37℃ 保温1小时至过夜。
– 叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2—3 次，至阴性对照材料呈白色。 – 肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色 小点即为Gus表达位点。
实验步骤 • 将准备好的拟南芥植株放入小EP管中，加 入染色液浸没试材，封好盖子； • 37℃培养箱中温育1小时至过夜； • 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱 色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料 呈白色为止。 • 观察结果。
敏度高而且重现性好，表达产物能进行定量测定。 • (4) 细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的 检测。
常见的报告基因：
• 在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有 以下几种： 常用的报告基因包括β—葡萄糖苷酸酶报告基因 (gus), 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基 因(ocs)、新霉素磷酸转移酶(NPTll)、氯霉素乙酰 转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶(β-gal，βgalactosidase)、萤光素酶(luc，luciferase)、和 绿色荧光蛋白基因(gfp，green fluorescence protein)等.
• 常用的选择标记基因包括有抗生素抗性基 因和除草剂抗性基因（Bar 基因）。标记 基因通常与目的基因构建在同一表达载体 上，一起转入生物，但有时，标记基因本 身就是目的基因，如除草剂抗性基因。
• 报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的 基因，也就是一个其表达物非常容易被鉴定 的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列 相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融 合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它 的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选 得到转化体。
实验八、转基因生物的GUS检测
实验目的：通过GUS(β- 葡萄糖苷酸酶)活性测定， 了解报告基因在基因工程中的应用。 要求：了解通过显色反应检验外源基因的表达情况 的方法，了解报告基因的概念。 技术应用：1. Gus基因与目的基因连接构建融合基 因进行组织定位； 2. gus基因与启动子连接来研究启动子的表达的组织 特异性。
材料： 转化的植物组织、器官、原生质体、
种子的胚及萌发的幼苗等。
非转化的相同材料（阴性对照）。
试剂： 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷酸酯 （X－Gluc） ；N-N-二甲基甲酰胺(DMF) ； NaH2PO4； Na2HPO4 ； Na2EDTA ；Triton-
100； K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）；K4
利用报告基因表达载体的研究技术的优点：
• 其一，避开内源和外源基因表达水平的影响：对于报告基 因编码产物的检测水平可以精确地反映基因启动子的转录
活性，不会受到内源性基因表达产物水平的影响.
• 第二，易于检测：如果研究不同基因启动子的转录活性， 采取本身基因表达产物的检测方法，必须建立各种基因表
达产物的检测方法，有些基因的表达产物的检测技术还不
药品配方
• 1）X－Gluc母液：X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺 (DMF)配成20mM的贮存液，分装成每管100µL，保 存于-20℃。 • 2）X－Gluc基液（50mM PBS， pH7.0）。 • 配制方法：50mM NaH2PO4· 0.78g/100ml；50mM Na2HPO4 1.79g/100ml共同溶解； Na2EDTA （10mM， 372mg），Triton-100（0.1％，100μ l）, K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）（0.5mM，16.5mg）K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）（0.5mM，21.1mg） • 染色液：50μ l X-Gluc母液＋450μ l基液
具备，或者很难建立，而采用报告基因的研究策略就很容 易解决这一问题，只要建立稳定的报告基因表达的检测技
术就可以用于不同基因启动子转录活性的检测和研究。
gus基因简介
• gus基因是目前常用的一种报告基因，是β －D－ 葡 萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β -葡萄糖苷酸酶 (GUS)能催化裂解一系列的β －葡萄糖苷酸 ，它可以 将5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷酸酯（X－Gluc） 分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β -D葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。 其检测方法简 单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。 • gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体 细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。
• 报告基因是研究基因调控的有力工具，常用于 判断试验基因的转化效率以及基因的调控与功 能的研究实验中。
报告基因必须具备的条件
• (1)已被克隆和全序列已测定;
• (2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被
转染的细胞中无相似的内源性表达产物;
• (3) 报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵
[Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）
原理
• 适宜的反应条件下，β- 葡萄糖苷酸酶 （GUS）可将X－Gluc水解成蓝色物质，因 此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或 蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
相关知识链接——标记基因 • 标记基因是帮助对转基因生物体进行 筛选和鉴定的一类外源基因，包括选择标 记基因和报告基因。