的 分地 离热 鉴水 定中 及好 影氧 响反 因硝 素化 研菌 究
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研究目的和意义
国内外研究进展
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主要研究内容及创新之处
拟采取的研究方案及可行性分析 研究计划及预期研究成果
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1、研究目的和意义
全球各地受到了不同程度的地下水污染，其中“三氮”污染比
较突出。 地下饮用水中硝酸盐浓度的升高会对人类的健康造成严重的危 害：蓝婴病、 “三致”、富营养化。 世界各国对饮用水中硝酸盐的含量都确定了标准值。我国的饮
用净水水质标准(CJ94-1999)规定为 l0mg NO3--N/L。
地下水中硝酸盐处理的常规方法离子交换法、反渗透法和电渗 析法等操作费用高昂，而且会产生不易处理的浓缩含卤废液。
与此相比，低成本、操作简单等特点使生物修复技术成为了最
具发展前景的主体修复技术。
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1、研究目的和意义
本文的研究目的有以下两点：
标及微生物群落的变化评价该菌的实际应用效果，分析其在微生物 法原位修复地下富氮水体技术中应用的可行性及前景，为其在硝酸
盐污染地下水处理的实际应用提供理论依据。
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河南理工大学研究生 学位论文开题报告
的 分地 离热 鉴水 定中 及好 影氧 响反 因硝 素化 研菌 究
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研究目的和意义
国内外研究进展
主要研究内容及创新之处
菌进行脱氮试验，通过水体中各项氮素指标及微生物群落的变化评价该菌的 实际应用效果，分析其在微生物法原位修复富氮地热水技术中应用的可行性 及其前景。
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3.2 创新之处
1 ）目前对好氧反硝化细菌的研究主要集中在污水脱氮领域，深层地热水 则是该研究的相对空白之处，本文研究的菌种来源于开封深层地热水中， 菌种来源具有代表性。 2 ）而且本研究从 35℃的地热水中提取反硝化菌，经过实验室驯化，反注 入到地热水中，实现本源反硝化菌进行地下水的原位处理，为今后的原位
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4.4 关键技术
（1）微生物培养技术 （2）荧光倒置显微镜使用技术 （3）菌株的16S rDNA测序、系统发育分析 （4）紫外分光光度法
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研究目的和意义
国内外研究进展 主要研究内容及创新之处
河南理工大学研究生学位论文开题报告
地热水中好氧反硝化菌 的分离鉴定及影响因素研究
汇报人：张淑楠
资源环境学院
2014年11月15日
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河南理工大学研究生学位论文开题报告
选题来源： 国家自然科学基金项目（40972164）
华北平原深部地热水亚硝酸盐增高的动位论文开题报告
图2-2 徐亚同.
图2-3 杨小龙等.
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pH值、温度对反硝化的影响
一株好氧反硝化细菌的分离鉴定及其除氮特性
2.3 环境因子对反硝化细菌的影响
（2）温度 温度对微生物的生长、繁殖有非常密切的关系，温度的高低直接影响酶 反应动力学、微生物生长繁殖速度以及化合物的溶解度等。
图2-4 马放,等.
图2-5 李卫芬,等.
图2-6 王弘宇, 马放, 苏俊峰, 等.
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不同碳源和碳氮比对一株好氧反硝化细菌脱氮性能的影响
2.3 环境因子对反硝化细菌的影响
（4） C:N 研究发现不同好氧反硝化细菌的最适C:N不同，在某个特定的范围内，有 机碳浓度越高，反硝化效果越好。
图2-7 杨新萍, 钟磊, 周立祥.
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有机碳源及DO对好氧反硝化细菌AD6脱氮性能的影响
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4.2技术路线
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图4-1 研究路线技术图 Fig. 4-1 Technical Framework
4.3 实验手段
（1）好氧反硝化细菌的分离纯化及高效菌株的筛选
配置 菌悬液
富集 培养
分离 纯化
菌种 保存
菌株 筛选
反硝化作 用验证
（2）细菌鉴定 1) 形态学鉴定 对菌株进行革兰氏染色后荧光倒置显微镜观察。 2) 生理生化鉴定 产气能力测定、氧化酶实验、接触酶实验、淀粉酶实验、明胶水解实验、 吲哚实验、硝酸盐还原实验、亚硝酸盐还原反应、甲基红实验、V-P实验。 3) 菌株的16S rDNA测序、系统发育分析
O2
NO3-
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图图2-1 细菌反硝化过程电子传递模型 Fig. 2-1 Electron transport chain of bacteria denitrification
2.3 环境因子对反硝化细菌的影响
（1）pH值 pH值直接影响酶的活性，环境中的氢离子浓度如果超过了微生物酶的适 应范围，微生物对营养物质的吸收和酶的活力都相应受到影响，而且会影响 反硝化酶的表达和反硝化的最终产物。
物降解过程。
方法：包括微生物修复和植物修复两种方式。微生物修复法就是采用工程 化方法利用微生物将土壤、地下水中的有毒有机污染物就地降解为CO2和水 或转化成无害物质。
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2.2 反硝化作用
概念：微生物把硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨氮和氮气的作用。
主要流程：NO3NO2NO N2O N2
作用机理：由Robertson等提出的协同呼吸理论，即反硝化菌可以将电子从 被还原的物质传递给氧气，同时也可以传递给硝酸盐。
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的 分地 离热 鉴水 定中 及好 影氧 响反 因硝 素化 研菌 究
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研究目的和意义 国内外研究进展
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主要研究内容及创新之处
拟采取的研究方案及可行性分析 研究计划及预期研究成果
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3.1 主要研究内容
（1）菌株的筛选及鉴定 采用模拟水对深层地热水进行驯化，用溴百里酚蓝(BTB)培养基从环境样
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5.2 预期研究成果
（1）从开封深层地热水中分离纯化出好养反硝化菌，实验室条件下通过 正交试验找出细菌的最适生长条件，绘出细菌的生长曲线，并通过单因子 变量法得出环境因子对细菌生长情况和脱氮能力的影响。 （2）通过16SrDNA测序并辅助生理生化指标的测定结果，确定所分离到 的菌株的种属类别，保留合适的菌株用于进一步研究。对相关的反硝化功 能基因进行鉴定，从分子水平证明其是否具备反硝化功能。 （3）将筛选得到的高效好氧反硝化菌应用于实践，在富氮深地热水中投 放该菌进行脱氮试验，通过水体中各项氮素指标及微生物群落的变化评价 该菌的实际应用效果，分析其在微生物法原位修复富氮地热水技术中应用 的可行性及其前景。
（1）采用模拟硝酸盐污染地下水（简称模拟水）对深层地热水进
行驯化，从环境样品中分离纯化出优良的好氧反硝化菌，通过单因 素摇瓶试验探讨不同环境因子对好氧脱氮性能的影响，来明确反硝 化菌株脱氮的控制方向和能力，确定其最佳脱氮条件。 （2）采用生物强化技术将筛选得到的高效好氧反硝化菌应用于实
践，在富氮水体中投放该菌进行脱氮试验，通过水体中各项氮素指
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4.3 实验手段
（3）确定细菌最适生长条件
以影响菌株发挥反硝化作用的主要因素pH值、温度、碳源、C:N及DO为主要考察 对象，以基础培养溶液为基础，依据正交实验分别加入不同组分或者改变某些组分的 用量和物理培养条件，分别实验。测定OD600、pH、NO3—N、NO2—N、TN，计算硝态 氮和总氮的去除率，以确定最适条件。
研究方案及可行性分析
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研究计划及预期研究成果
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5.1 研究计划
2014.09—2014.11 资料收集，采集开封深层地热水样品，测定其组成成分 含量，并对水样中好氧反硝化细菌进行分离纯化； 2014.12—2015.01 对分离出来的高效好养反硝化菌进行生理生化鉴定，并 进行正交试验找出细菌最佳生长条件； 2015.02—2015.04 进行单因子对细菌脱氮能力的影响实验研究； 2015.05—2015.06 进行富氮地热水脱氮实验，验证好养反硝化菌的脱氮能 力； 2015.07—2015.08 实验数据分析，撰写论文； 2014.09—2015.11 修改完成论文，进行答辩。
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一株好氧反硝化细菌生理生态特征的研究
1株好氧反硝化菌的分离鉴定及反硝化特性的研究
2.3 环境因子对反硝化细菌的影响
（3）碳源 在异养微生物生长繁殖过程中，有机碳源为其提供能量并作为细胞的主 要组成成分。而反硝化过程是一个耗能反应，亦需要微生物分解有机物为其 提供能量。
脱氮率80%
脱氮率97. 30% 脱氮率97. 57%
拟采取的研究方案及可行性分析 研究计划及预期研究成果
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2.1 微生物原位修复富氮地下水
概念：地下水原位生物修复技术是指对于受硝酸盐氮污染的地下水体，不 作抽提或运输，而直接在原位进行生物修复，其修复过程主要依赖于地下 水体中的反硝化细菌和人为创造的促进反硝化作用的条件。 原理：实际上是自然生物降解过程的人工强化，是通过采取人为措施，包 括添加氧和营养物等，刺激原位微生物的生长，从而强化污染物的自然生
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3.1 主要研究内容
（3）单因子对细菌脱氮的影响 把菌株接种到反硝化性能测定培养液中，分别以单因子为变量测定培养
液中菌株的生长情况及NO3- -N、NO2- -N、TN的浓度变化，确定单个因子对
细菌生长情况和脱氮能力的影响。 （4）富氮地热水脱氮实验
将筛选得到的高效好氧反硝化菌应用于实践，在富氮深地热水中投放该
2.3 环境因子对反硝化细菌的影响
（5）溶解氧DO 在有氧环境中，NO3-及O2皆可被好氧反硝化细菌作为电了受体完成呼吸 作用。当溶解氧含量升高时，往往会抑制反硝化酶系中相关酶的表达或活性， 从而使反硝化作用减弱。 一般认为，当溶解氧浓度低于3 mg/L时，好氧反硝化菌具有反硝化活性。 但也有研究发现了个别对溶解氧耐受较强的菌株。Kim等从土壤中筛得一株 Pseudomonas putida AD-21，其在溶解氧达5~6 mg/L时仍具备较强的反硝化能 力。Stouthamer等发现的一株柠檬酸杆菌在溶解氧为5 mg/L时仍然具备反硝化 活性。显然，菌株对溶解氧的耐受能力越强，则其好氧反硝化能力越高。