中期考核汇报
张婧 导师：罗深秋教授 时间：2006-03-23
2019/8/24
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课题名称
AMP 激活蛋白激酶（AMPK）靶向 治疗肝纤维化作用机理的研究
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• 肝脏疾病严重危害着人们的健康。
• 卫生部2005年的统计资料显示：
• 我国约有1.2亿人携带乙肝病毒，慢性乙肝患者约3000 万；
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腺病毒的转染
• 设置不同的病毒的梯度感染细胞：0、10、 20、40、80、100pfu，分别在18h和、30h、 48h提取蛋白，进行目的蛋白表达的检测， 以确定病毒的用量和收获细胞的时间。
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外源基因表达的检测
• 1.western blotting检测外源基因的表达： 用抗Myc-标签的抗体作为一抗检测。
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HSCs的分离
• CL2MDP质脂体的制备 • 质脂体尾静脉注射3d • 灌注、分离肝脏 • 纱网过滤、密度梯度离心 • 培养
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HSCs的鉴定
1.Anti－desmin的抗体做免疫组化 2.油红o染色 3.荧光显微镜观察
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分离的HSCs
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• 香港大学徐爱民教授与伦敦MRC研究中心的 David Carling 博士的合作课题中，对AMPK在激 活的大鼠HSCs细胞的功能作用进行了初步的探讨。 他们发现腺病毒介导的组成性激活的AMPK的过 表达能明显的诱导激活的大鼠HSCs 细胞产生凋 亡。
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技术路线
HSCs的分离
HSCs的鉴定和培养
人肝星状细胞株LX-2 的培养鉴定
腺病毒转染 外源基因表达的检测
细胞凋亡的检测
动物实验
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课题进展
• 分离、鉴定了大鼠的肝形状细胞； • 鉴定了LX2细胞 • 正在摸索合适的病毒感染的数量，以及感
染后收获细胞的时间。
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Thank you！
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抗纤维化的治疗策略
• 去除病因，减少炎症; • 抑制HSCs 激活和细胞外基质合成; • 促进基质降解； • 肝细胞再生； • 促进HSCs的凋亡。
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• 近来的研究表明，AMP激活的蛋白激酶（AMPK） 持续性的激活可以引发细胞的凋亡 。有实验证明 持续的AMPK的活性可以诱导MIN6、原代的β－ cell、Jurkat等细胞的凋亡。
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• 肝脏星形细胞(hepatic stellate cells ,HSC) 又称贮脂细胞(fat－storing cell ,FSC) ,具有
贮存脂肪供肝细胞能量、贮存及代谢维生 素A、合成细胞外基质的功能。在炎症、化 学物质等致病因素刺激下HSCs 可活化、增 殖并产生大量的胶原,是形成肝纤维化的中 心环节。
• 2.免疫组化检测
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细胞凋亡的检测
• 形态学的观察 • 流式细胞仪的检测 • DNA ladder分析 • JNK表达的变化 • Caspase3表达的变化 • Bcl－2表达的变化
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动物实验
• 酒精诱导的小鼠肝损伤 （含乙醇的高脂肪流质食物喂食4周） • 四氯化碳诱导的肝纤维化 （腹腔注射四氯化碳6周 ） • 动物模型通过尾静脉注入表达组成性激活的AMPK或荧光素酶的重组
• 慢性丙肝患者3800万； • 脂肪肝患者约5000万； • 药物、中毒、自身免疫性肝病患者1000万人。 • 每年约有50万人死于慢性乙肝相关疾病。
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肝纤维化是诸多慢性肝病发展至肝硬化 过程中所共有的病理组织学变化。近年来 的研究已经证实肝纤维化是由于肝星状细 胞（hepatic stellate cell, HSC)分泌了过多 的胞外基质，并在肝脏内沉积而形成的。
腺病毒，在预定时间后，取老鼠的肝脏进行以下分析： （1）免疫组化评估肝损伤的程度，炎症灶，HSCs细胞的激活，胶原 的含量等； （2）检测参与肝脏炎症和纤维化的关键基因，如TNF，和胶原家族 成员的表达水平，通过这一体内实验，以期确定AMPK的激活是否能 有效预防和逆转肝纤维化。
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