Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２．Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６ 中国临床医学 ２０１２年１２月 第１９卷 第６期 ·论著· 肺炎支原体的分离鉴定与药敏性研究刘展１＊ 袁春丽１＊ 李青凤２ 汪水城１ 王本旭２（１．北京市怀柔区妇幼保健院，北京 １０１４００；２．北京军区疾病预防控制中心，北京 １０００４２）摘要 目的：探讨肺炎支原体的临床分离株对临床常用药的敏感性。
方法：将临床采集的咽试子标本经过选择性培养基筛选培养，同时进行聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）检测，确定分离到的支原体为肺炎支原体。
将肺炎支原体与不同浓度的临床常用抗生素混合，观察液体培养基颜色的变化，判断肺炎支原体对药物的敏感性。
结果：成功分离到１株肺炎支原体；阿奇霉素、红霉素和头孢呋辛钠浓度分别稀释至３１μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ时，肺炎支原体抑制；而头孢曲松钠、美洛西林、氨苄青霉素等抗生素对支原体无抑制作用，培养基颜色均由红色变为橙黄色。
结论：肺炎支原体临床分离株对阿奇霉素高度敏感，对红霉素和头孢呋辛钠中度敏感。
关键词 肺炎支原体； 分离鉴定； 药敏性中图分类号 Ｒ７２５．６ 文献标识码 ＡＩｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＬＩＵ Ｚｈａｎ１ ＹＵＡＮ Ｃｈｕｎｌｉ１ ＬＩＱｉｎｇｆｅｎｇ２ ＷＡＮＧ Ｓｈｕｉｃｈｅｎｇ１ ＷＡＮＧ Ｂｅｎｘｕ２ １．Ｈｕａｉｒｏｕ Ｍａｔｅｒｎａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０１４００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｃｏｍｍａｎｄ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４２，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｓａｍｐｌｅｓｏｆ ｔｈｒｏａｔ ｓｗａｂ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＰＣＲ．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｗｅｒｅｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｉｆ ｏｎｅ ｄｒｕｇ ｃｏｕｌｄ ｋｉｌｌ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ，ｔｈｅ ｃｏｌｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｄｉａ ｗｏｕｌｄ ｎｏｔ ｃｈａｎｇｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｏｎｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｔｙｐｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ｅｒｙｔｈｒｏ－ｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ ｓｏｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ｄｉｌｕｔｅｄ ｔｏ ３１μｇ／ｍＬ，１２５μｇ／ｍＬ，５００μｇ／ｍＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｗｅｒｅｓｕｐｒｅｓｓｅｄ．Ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ，ｍｅｚｌｏｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ｈａｄ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｒｏａｔ ｓｗａｂ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｅａｓｉｌｙ ｂｙ ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ．Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎａｎｄ ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｓｏ ｈａｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ Ｍｙｃｏｐｌｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ； Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ＊刘展和袁春丽为共同第１作者基金项目：北京市首都医学发展科研基金（编号：２００９３２６７）通讯作者 王本旭，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｂｅｎｘｕ２０２８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ 支原体肺炎是肺炎支原体（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕ－ｍｏｎｉａｅ，ＭＰ）引起的肺炎。
支原体肺炎起病缓慢，患者有发热、阵发性刺激性咳嗽、少量黏液性或黏液脓性痰。
支原体肺炎多发于青少年，患病率占肺炎的１５％～３０％［１］。
目前临床治疗支原体肺炎的常用药物包括阿奇霉素、红霉素等［２］。
本研究旨在通过探讨ＭＰ临床分离株对临床常用抗生素的敏感性，为临床治疗支原体肺炎提供用药依据。
１ 资料与方法１．１ 材料 乳糖酸阿奇霉素（东北制药集团沈阳第一制药有限公司，０．２５ ｇ，２５万Ｕ／瓶），头孢呋辛钠（Ｅｓｓｅｔｉ Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ ｓ．ｒ．ｌ，Ｉｔａｌｙ，０．７５ ｇ／瓶），头孢曲松钠（上海罗氏制药有限公司，０．５ ｇ／瓶），青霉素（石家庄制药集团有限公司，１ ｇ／瓶）；美洛西林（华北制药有限公司，１ ｇ／瓶）；乳糖酸红霉素（湖南中南科伦药业有限公司，０．２５ ｇ／瓶）；支原体培养基ＣＭ０４０１、ＣＭ０４０３、ＳＲ００５９和ＳＲ００６０Ｃ（Ｏｘｏｉｄ公司，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）；核酸分子量标准ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（大连宝生物工程有限公司）。
１．２ 研究方法１．２．１ 双向培养基制备 １００ ｍＬ蒸馏水中加入３．５５ ｇ ＣＭ０４０１，１２１℃高压灭菌１５ ｍｉｎ，每个１５ｍＬ培养管中加入１ ｍＬ灭菌后的ＣＭ０４０１培养基，自然凝固。
取１支ＳＲ００６０Ｃ，加入２０ｍＬ蒸馏水溶解。
向每个培养管中加入２ ｍＬ ＳＲ００６０Ｃ，４℃保存备用。
１．２．２ 咽拭子标本选择性培养与鉴定 将咽拭子标本浸入双向培养基中，３７℃培养２周左右。
当培养基颜色由红色转变为橙黄色时，将培养液于ＭＰ固体培养（ＣＭ０４０３＋ＳＲ００５９＋琼脂粉）上划板培养，直至镜下看到“油煎蛋”样菌落长成为止。
挑取菌落于双相培养基中继续培养，观察培养基颜色变化。
１．２．３ ＭＰ的ＰＣＲ鉴定方法 支原体核酸提取方法参照ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ２２６ 中国临床医学 ２０１２年１２月 第１９卷 第６期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２．Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６Ｎｏ：６９５０４）说明书进行。
引物参照文献［３］设计如下：上游引物为５’—ＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴ－ＡＧＡＴＡＣＣＣＴ－３’；下流引物为５’－ＴＧＣＡＣ－ＣＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＣＴ－３’。
反应条件为９４℃，５ ｍｉｎ；９４℃，３０ ｓ；５５℃，３０ ｓ；７２℃，３０ ｓ；２８个循环；７２℃处理１０ ｍｉｎ。
扩增片断长度为２８０ｂｐ。
以正常双向培养基为阴性对照。
１．２．４ ＭＰ药敏性实验 将ＭＰ分别与终浓度为５ｍｇ／ｍＬ、１ ｍｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ和１μｇ／ｍＬ的阿奇霉素、红霉素、头孢呋辛钠、头孢曲松钠、氨苄青霉素和美洛西林钠共同培养，观察培养基颜色的改变。
待某２个浓度间培养基颜色出现变化后，进一步稀释至合适的药物浓度。
阴性对照不加任何抗生素。
２ 结 果经过多轮特异的选择性的双相培养基筛选，成功分离到１株ＭＰ，该支原体能够特异性地生长在双相培养基中，而且符合双相培养基颜色变化。
提取ＭＰ核酸，经过ＰＣＲ扩增，得到２８０ ｂｐ特异扩增带，与预期结果一致。
见图１。
图１ ＭＰ的ＰＣＲ扩增鉴定结果当阿奇霉素、红霉素、头孢呋辛钠终浓度分别稀释至３１μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ时，ＭＰ培养基颜色不变，随着抗生素浓度降低，ＭＰ培养基颜色会逐渐由红色变为橙黄色。
而头孢曲松钠、美洛西林钠和氨苄青霉素在不同浓度下培养基颜色都由红色变为橙黄色。
ＭＰ在不同浓度抗生素的双相培养基中颜色的相对变化指示见表１。
表１ ＭＰ于不同浓度抗生素中培养基颜色变化情况项目药物浓度培养基颜色变化情况（＋颜色有变化，－代表颜色无变化）阿奇霉素红霉素头孢呋辛钠头孢曲松钠青霉素美洛西林钠５ ｍｇ／ｍＬ－－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋２ ｍｇ／ｍＬ－－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋１ ｍｇ／ｍＬ－－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋５００μｇ／ｍＬ－－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋２５０μｇ／ｍＬ－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋１２５μｇ／ｍＬ－－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋１００μｇ／ｍＬ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋６２．５μｇ／ｍＬ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋３１μｇ／ｍＬ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋１５μｇ／ｍＬ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋１０μｇ／ｍＬ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋３ 讨 论ＭＰ是介于细菌与病毒之间的一种微生物，是可独立生活的最小生物个体，可吸附于呼吸道上皮细胞表面并破坏细胞表面，产生过氧化氢引起肺部组织损伤，引发一系列的病理免疫反应［４］。
关于临床治疗支原体肺炎时各种抗生素针对ＭＰ的有效抑制浓度，目前鲜有报告。
分离ＭＰ比较困难，主要原因之一是其生长和增殖速度非常慢，在固体琼脂培养板上需要生长两周以上才能在镜下看到菌落。
本研究采用Ｏｘｏｉｄ公司生产的对ＭＰ具有选择性筛选作用的培养基进行初步培养与筛选，然后通过支原体种属特异性引物进行ＰＣＲ扩增鉴定，分离到了１株ＭＰ临床株。
本研究显示，阿奇霉素对ＭＰ的有效抑制浓度为３１μｇ／ｍＬ，而红霉素最低有效抑制浓度为１２５μｇ／ｍＬ。
这说明该株ＭＰ对阿奇霉素较敏感，对红霉素出现了一定的抗药性，故临床治疗支原体肺炎时应首选阿奇霉素，而非红霉素。
本研究发现，头孢呋辛钠对ＭＰ具有一定的抑制作用，其最低抑制浓度为５００μｇ／ｍＬ。
本研究结果首次证实了头孢呋辛钠能够有效抑制ＭＰ的生长。
但同为β－内酰胺类抗生素的头孢曲松钠、美洛西林以及氨苄青霉素对ＭＰ生长却无抑制作用，其原因有待进一步研究。
参考文献［１］ 陈玲玲，成云改，陈志敏，等．肺炎支原体肺炎患儿混合感染的研究［Ｊ］．中华儿科杂志，５０（３）：２１１－２１５．［２］ 童海燕．重症支原体肺炎５６例治疗分析［Ｊ］．中国临床医学，２０１０，１７（５）：６６１－６６２．［３］ 李淳，吴移谋，朱翠明，等．ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ检测咽拭子标本肺炎支原体的比较［Ｊ］．中国人兽共患病学报，２０１２，２８（２）：１２７－１３０．［４］ 陈志敏．肺炎支原体肺炎的再认识—从发病机制到临床治疗的探讨［Ｊ］．中国实用儿科杂志，２０１２，２７（４）：２５３－２５７．３２６。