多粘菌素
凝胶过滤
CHT和CFT
层析介质及其技术
凝胶过滤层析 离子交换层析 羟基磷灰石层析 疏水层析 亲和层析
凝胶过滤层析
分离纯化原理
凝胶过滤层析
凝胶的选择
100 Bio-Gel P2 100 Bio-Gel P4 Bio-Gel P6 Bio-Gel P10 Bio-Gel P30 Bio-Gel P60 Bio-Gel P100 800 1,000 1,500 2,500 3,000 5,000 1,000 1,800 4,000 6,000，用于脱盐 20,000 40,000 60,000 100,000 10,000 100,000
pI
2
stability range 与阴离子交换 介质结合
10
pH
-
denaturation
离子交换层析
离子交换层析原理
Products:
UNOsphere™ Q & S, Macro-Prep® High Q & S, CM, DEAE, AG® resins
-
+ ++ + + + + ++ + + + + ++ + + +
凝胶过滤层析用于工艺的特点：
1. 层析柱规模很大，实验室1.5×50cm以上，2.5×100cm，工艺 10－20×200cm，从而设备成本很高；
2. 上样体积少，必须少于柱床体积的3％才能达到较好的分离效果， 如果大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的 复杂性；
3. 工艺时间（生产周期）长，24小时或以上；
4. 分辨率低；
5. 不需摸索纯化条件，按照分子量区带大小洗脱。 因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步去热原，或离子
交换上样前的脱盐
离子交换层析
离子交换层析类型及其选择
anion cation
weak DEAE
Diethylaminoethyl
-O-CH2CH2-NH+ C2H5 C2H5
2006
Profinia
Model 2110
2700/2800 HPLC System
Maximizer
BioFrac
层析原理与操作
原理与操作
层析的起源和原理
• 起源----1906年，俄国植物学家Tsweet • 原理----利用物质分配系数不同达到分离 目的
0.100 0.090 0.080 0.070 0.060
High Pressure pumps and detectors（高压 泵和检测器）
1986
1988
BioLogic HR medium pressure system completes our chromatography line
2001
1999
EGP
New products, new systems, welcome to our presentation
strong
Q
Quaternary amine
-N+(CH3)3
weak
CM
Carboxymethyl
O -O-CH2-C-O-
strong
S
Sulfonate
-SO3-
离子交换层析
离子交换层析原理——蛋白质滴定曲线
+
蛋 白 质 净 电 荷 与阳离子交换 介质结合
stability range denaturation
Fractions 37 40 42 44 46 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 -0.25 00:00:00
59 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 -0.25 00:00:00 00:30:00 Hr:Min:Sec
Unosphere Q，S MacroPrep High Q,High S,DEAE,CM
凝胶过滤层析介质
Bio-Gel P系列 Bio-Beads S-X介质
亲和层析
Profinity IMAC金属螯合介质 Profinity Epoxide环氧亲和介质 Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel蓝胶，DEAE蓝胶，CM蓝胶 Affi-Prep多粘菌素介质 Affi-Gel硼胶 Affi-Gel配体固定化活化介质
• 这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相 和流动相的分配不同而达到分离
原理与操作
层析技术
• Ion Exchange (IEX)－离子交换
–电荷 – 可用于 层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和 最后的精细纯化
• Size Exclusion (SEC)－分子筛（或凝胶过滤） –分子大小 – 用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化
-
+ ++ + + +
+ ++ + + +
-
+ ++ + + + + ++ + + + + ++ + + +
+ ++ + + + + ++ + + +
Equilibration
Sample Application
Sample Adsorption
Elution
Regeneration
离子交换层析
离子交换层析操作参数选择
Unosphere MacroPrep
Q，S，DEAE，CM
疏水层析 -CH3, t-Butyl 亲和层析 Protein A IDA－Ni
Profinity IMAC Profinity Epoxide Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel, DEAE, CM Affi-Prep Polymixin Affi-Gel硼胶 Affi-Gel配体固定化活化 MacroPrep Methyl HIC MacroPrep t-Butyl HIC
羟基磷灰石介质（CHT） 氟代羟基磷灰石介质（CFT） 疏水层析介质
Macro-Prep Methyl HIC Macro-Prep t-Butyl HIC Bio-Beads SM-2吸附剂
层析柱
分析柱

离子交换分析柱：Uno Q, S Aminex分析柱——分析单糖、寡糖、有机酸、有机碱，以及 羟基磷灰石分析柱：Bio-Scale CHT-I 凝胶过滤分析柱：Bio-Sil, Bio-Silect HPLC 分析柱 反相层析分析柱：Hi-Pore RP304, Hi-Pore RP318 UNO Column
00:00:00 AU
01:00:00 Hr:Min:Sec
02:00:00 Volts
原理与操作
什么是生物层析
• 根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离
– 极性：polarity (solubility, volatility) HIC, RP – 离子特性：ionic characteristics (charge) IEX – 大小与形状：size/mass (diffusion, sedimentation) GF – 结构特征与活性位点：shape (ligand binding, affinity) AC
–独特分离机理，包含离子交换和金属螯合等,可用于 层析的任何步骤，根据纯 度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化
原理与操作
液相层析
• 最广泛的蛋白质分离纯化方法
– 条件温和 – 维持蛋白质空间结构与活性
• 基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离 • 蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子 分离
10 pH
-
蛋白质稳定性范围
离子交换层析
离子交换层析操作参数选择
缓冲液与pH的影响——阴离子交换
1 34 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 -0.25 00:00:00 00:30:00 Hr:Min:Sec Fractions 19 21 24 25 01:00:00 Fractions 57 9 12 1416 10.00 9.50
• Affinity (AC)－亲和
–生物相互作用 – 用于复杂样品的最早捕获或中间纯化 • Hydrophobic Interaction (HIC和RP) －疏水和反相 –疏水相互作用- 用于中间纯化，去除脂类和脂多糖
• Ceramic Hydroxyapatite (CHT) & Ceramic Fluoroapatite (CFT)－羟基磷灰石
1989
Econo System,
stormed the low pressure market （席卷 低压市场）
BioLogic BioLogic LP DuoFlow
1997
2000
Detector
1996 LP Data View
QuadTec
2007
1950
Profinity eXact
1994
Fractions 0.500 0.450 0.400 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 -0.050