当使用粗内径短柱或细内径长柱时，应注意由于柱内体积 减小，由柱外效应引起的峰形扩展不可忽视。此时应对进样 器、检测器和连接接头作特殊设计以减少柱外死体积。这对 仪器和实验技术提出了更高的要求。但这样会降低流动相的 消耗量并提高检测灵敏度。
（二）柱连接方式
柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上 下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结
③对高分子化合物或粘度大的样品，分析时柱温必须高于室温。
④对一些具有生物活性的生物分子，要求分析时柱温应低于室 温。
⑤对某些组成复杂的样品，在单一色谱柱不能实现完全分离， 需要使用二维色谱技术，利用柱切换，使两根色谱柱在不同柱温 下操作，以实现多组分的完全分离。
一个理想的HPLC柱温控制系统，如HPll00高效液相色谱仪可 以实现从低于室温10℃至80℃柱温的精确控制。对凝胶渗透色谱 仪，其柱温可从室温至150℃实现精确控温。
（三）柱温控制
在高效液相色谱分析中，温度的影响往往容易被忽略，现随分 析样品复杂性和多样性的不断出现；人们对分析结果准确度和精 密度的要求不断提高，柱温的控制日益受到人们的重视。在以下 几种情况需精确控制柱温：
①在一些法定标准分析方法中，要求保留时间具有再现性。
②必须通过改变柱温来提高分离效率。
②溶质性质检测器 此类检测器只检测柱后流出液中溶质的 某一物理或化学性质的变化。例如，紫外吸收检测器(UVD) 和荧光检测器(FD)，它们分别测量溶质对紫外光的吸收和溶 质在紫外光照射下发射的荧光强度。此类检测器灵敏度高， 可单流路或双流路补偿测量，对流动相流量和温度变化不敏 感。但不能使用对紫外线有吸收的流动相。
常用的检测器为紫外吸收检测器(UVD)、折光指数检测器 (RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。
在高效液相色谱技术发展中，检测器至今是一个薄弱环节， 它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子 化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸 发激光散射检测器(ELSD)有望成为高效液相色谱全新的通用 灵敏的质量检测器。
第五章 高效液相色谱法
高效液相色谱（High Performance Liquide Chromatography）还可称为高压液相色谱 （High Pressure Liquide Chromatography）、高速液相色谱（High Speed Liquide Chromatography）、高分 离度液相色谱（High Resolution Liquide Chromatography）或现代液相色谱 （Modern Liquide Chromatography）。
的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰
面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全
的分析工具。
高效液相色谱仪的组成
1一贮液罐；2一搅拌、超声脱气器；3一梯度淋洗装置；4一 高压输液泵；5一流动相流量显示；6一柱前压力表；7一输液 泵泵头；8一过滤器；9一阻尼器；10一六通进样阀；11一色 谱柱；12一紫外吸收(或折光指数)检测器；13一记录仪(或数 据处理装置)；14一回收废液罐
方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相
色谱法的特点，应用范围和局限性的前提下，充分利用高效液
相色谱法的特点，就可在解决实际任务中发挥重要的作用。
第四节 高效液相色谱仪简介
高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能
各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品
仪器可有如下两种组合方式：
①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高
效液相色谱仪总体实用的特点。
②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析
目的，组装成不同的联接方式。
现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很
高，即能控制仪器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、
柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等)，又能对获得
材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让
流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒， 柱出、入口的连接管的死体积亦
应愈小愈好，一般常用窄孔
(内径0.13mm)的厚壁(1.5—
2.0mm)不锈钢管，以减少柱
外死体积。所用柱接头，联
接螺帽，密封圈及色谱柱接
头皆为不锈钢材料。
1一柱接头；2一联接柱螺帽；3一接连接管的螺帽； 4—孔径0.45um的纤维素滤膜；5一多孔不锈钢烧结片； 6一柱密封圈(卡套)；7一连接管密封圈(卡套)； 8一色谱柱管；9—连接管
它们可用于痕量分析和梯度洗脱。
(2)按适用性分类
①选择性检测器 它对不同组成的物质响应差别极 大，因此只能选择性的检测某些物质，如紫外吸收检 测器、荧光检测器和电导检测器。
②通用型检测器 它对大多数物质的响应相差不大， 几乎适用于所有物质。折光指数检测器属于通用型检 测器，但它的灵敏度低，受温度影响波动大、使用时 有一定局限性。
(3)离子色谱(Ion Chromatography) 用高效微粒离子 交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动 相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上 表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实 现分离。
(4)体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography) 用 化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中 各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。以水溶 液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色谱 (Gel Filtration Chromatography)；以有机溶剂作流动 相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography)。
第二节 高效液相色谱法的分类
高效液相色谱法可依据溶质(样品)在固定相和流动相 分离过程的物理化学原理分类。
(1)吸附色谱(Adsorption Chromatography) 用固体 吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样 品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
(2)分配色谱(Partition Chromatography) 用载带在固相基体上 的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各 组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液 体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配 色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配 色谱或简称正相色谱(Normal Phase Chromatography)；若固定 相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反 相色谱(Reversed Phase Chromatography)。
(5)亲和色谱(Affinity Chromatography) 以 在不同基体上，键合多种不同特性的配位体 作固定相，用具有不同pH值的缓冲溶液作流 动相，依据生物分子(氨基酸、肽、蛋白质、 核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等)与基体上 键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能 力的差别，而实现对具有生物活性的生物分 子的分离。
(一)、检测器的分类和响应特性
1．分类
(1)按检测的对象分类
①整体性质检测器 检测从色谱柱中流出的流动相总体物理 性质的变化情况。如折光指数检测器(RID)和电导检测器(CD)， 它们分别测定柱后流出液总体的折射率和电导率。此类检测 器测定灵敏度低，必须用双流路进行补偿测量；易受温度和 流量波动的影响，造成较大的漂移和噪声；不适合于痕量分 析和梯度洗脱。
一、高压输液泵
对高压输液泵的要求是：
①泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢 （Cr1Ni8Ti9）或优质耐酸不锈钢(Cr18Nil2Mo2)。为防止酸、 碱缓冲溶液的腐蚀，在离子色谱或亲和色谱分析中现已使用 由聚醚醚酮(PEEK)材料制成的高压输液泵。
②能在高压下连续工作。通常要求耐压40~50MPa·cm-2， 能在8～24h连续工作。
③输出流量范围宽。对填充柱：0.1～l0mL／min(分析型)； 1~100mL／min(制备型)。对微孔柱：10～1000uL／min(分析 型)；1~9900uL／min(制备型)。
④输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器， 大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这 样可以降低基线噪声并获较好的检测下限。流量控制的精密 度应小于1％，最好为0.5％，重复性最好为0.5％。
高压输液泵可以分为如下两类： 1．恒流泵 恒流泵可输出恒定体积流量的流动相。
2．恒压泵 恒压泵又称气动放大泵，是输出恒定压力
的泵。
二、进样装置
（一）六通阀进样装置
此阀的阀体用不锈钢材料，旋转密封部分由坚硬的 合金陶瓷材料制成，既耐磨、密封性能好。当进样 阀手柄置“取样”位置，用特制的平头注射器(10ul) 吸取比定量管体积(5ul或l0ul)稍多的样品从“6”处 注入定量管，多余的样品由“5”排
法的一种通用型检测器。
第三，高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求
柱效高达10万块理论塔板数以上，必需用毛细管气相色谱法分
析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。
第四，高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在
200kPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性
的生化样品。
综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析
二、方法的局限性
第—，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，
当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。
当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。
第二，高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用
型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器)。近年来蒸发
激光散射检测器的应用日益增多，有望发展成为高效液相色谱
第三节 高效液相色谱法的应用范围和局限性
一、应用范围