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第二章 基因工程工具酶

第二章 基因工程工具酶
• 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功 能的酶类。 • 这些酶类参与微生物的核酸代谢 , 在核酸复制和 这些酶类参与微生物的核酸代谢, 修复等反应中具有重要作用, 修复等反应中具有重要作用 , 有的酶还作为微生 物区别自己和非己的DNA进而降解非己 进而降解非己DNA的防 物区别自己和非己的 进而降解非己 的防 御工具。 御工具。 • 在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操 作方法后,人类获得了最好的基因工程工具。
识别序列
• 识别序列有连续的(如GATC)和间断的(如 GANTC)两种,它们都呈回文结构。
A B C C’ B’ A’ 或 A’ B’ C’ C B A
A B N A’ B’ N’
B’ A’ 或 B A
A B A B
B’ A’ B’ A’
• 回文结构(palindrome):序列正读和反读 是一样的,即有一个中心对称轴,从这个 轴朝两个方向读序列是完全一样的。 • 在切割位点处,限制性核酸内切酶的作用 下磷酸二酯键会发生水解效应,从而导致 链的断裂。
识别序列
TGAN8TGCT AACN6GTGC
旋转对称序列
距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下 切割位点 随机性切割 特异性切割 游24-26bp处
二、限制性内切酶作用机制 限制性内切酶以双链DNA为底物,识 别特定的核苷酸序列,切断特定位置的磷 酸二酯链,产生具有3’-OH和5’-P的DNA片 段。
BamH I 5’ XXXXGGATCCXXXXXX 3’ 3’ XXXXCCTAGGXXXXXX 5’ Bgl II 5’ XXXXAGATCTXXXXXX 3’ 3’ XXXXTCTAGAXXXXXX 5’
5’ XXXXG
GATCCXXXXXX 3’ GXXXXXX 5’
5’ XXXXA
GATCTXXXXXX 3’ AXXXXXX 5’
四、限制性内切酶切割DNA的位点 限制性内切酶切割 的位点
限制性内切酶切断DNA链上磷酸二酯键的位置一般 在识别序列内部,如G↓GATCC, AT↓CGAT; 也有少数在识别序列的两端,如↓GATC, CATG ↓。 环状DNA分子上,若某种限制性内切酶有n个识别序 列,则完全切割后可获得n个片段。线状DNA分子,若 某种限制性内切酶有n个识别序列,则完全切割后可获 得n+1个片段。
限制性核酸内切酶( 限制酶) 限制性核酸内切酶 ( 限制酶 ) : 在细 胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷 胞内能够识别双链 分子中的特定核苷 酸序列, 并对DNA分子进行切割的一种酶 。 分子进行切割的一种酶。 酸序列 , 并对 分子进行切割的一种酶 功能:降解不同源DNA,而不降解同 源DNA。 基因工程所用的限制性内切酶可从生产 厂家购买,如NEB, Fermentas, SibEnzyme。 国内市场上常用的是TaKaRa。
基因工程的工具酶(instrumental enzyme of gene engineering)是应用于 基因工程各种酶的总称,包括核酸序 列分析、标记探针制备、载体构建、 目的基因制取、重组体DNA制备等所 需要的酶类。
第一节 限制性核酸内切酶
在限制修饰系统中,限制作用是指一定类型 的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏 入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等),使得外源 DNA对生物细胞的入侵受到限制; 而生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化 酶的作用,在碱基特定位置上发生了甲基化,可 免遭自身限制性内切酶的破坏。 限制-修饰作用实际就是细菌中的限制性内 切酶降解外源DNA ,维护自身遗传稳定的保护机 制。
限制性核酸内切酶的命名
属名 种名 株名 嗜血流感杆菌d株 嗜血流感杆菌 株
Haemophilus influenzae d
Hind Ⅲ
Hind Ⅱ
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的分类
特性 限制和修 饰活性 Ⅰ型 单一功能 Ⅱ型 单一功能 Ⅲ型 双功能 相距5-10bp 意义不大
限制性内切酶作用过程
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三、限制性内切酶的识别序列
限制性内切酶在双链DNA上识别的特殊核苷酸序列称为 识别序列。 绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4~8个 核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是 从其识别序列内切割DNA分子的,因此这些识别序列又叫 核酸内切酶的切割位点或靶序列。 理论上,某限制性内切酶的识别序列长度为n个核苷酸, n n 则该酶切割DNA的频率为1/4 ,也就是说DNA每隔4 个核 苷酸便 会出现一次该酶的识别序列。
3.识别序列的旁邻序列 识别序列的旁邻序列 限制性内切酶不会切割仅含有识别序列的寡 核苷酸时,识别序列两端必须要有若干个核苷酸 才能切割。 4.位点偏爱(site preference) 位点偏爱( 位点偏爱 ) 某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序 列表现出不同的切割效率。与识别序列两侧的核 苷酸序列有关。 5.DNA甲基化 甲基化
[DNA]过大,抑制酶活,影响酶分子扩散
如:4µg DNA/1U 1µg DNA/1U HpaⅠ 50µl 37℃ 15h HpaⅠ 50µl 37℃ 1h
(二)限制性内切酶的用量 二 限制性内切酶的用量
50µL Buffer中,含1µg底物DNA,于最适反 应条件和温度下,保温1小时,能使1µg DNA完全 降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位,用U表示。
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点 几种 型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164 Haemophilus influenzae Rd
CTGCAG GACGTC
不同核酸内切酶的特异识别位点
Pst I
5’…… C T G C A G……3’ 3’ ……G A C G T C ...…5’
• 例如 例如HpaⅡ和MspⅠ是同裂酶,识别顺序都是 Ⅱ Ⅰ 同裂酶, 5’……C↓CG G……3’ 3’……G GC↑C……5’ • 如果其中有 甲基胞嘧啶,HpaⅡ不能够切割, 如果其中有5’-甲基胞嘧啶 甲基胞嘧啶, Ⅱ不能够切割, MspI能切割。 能切割。 能切割
经同尾酶消化的 同尾酶消化的DNA末端连接示意图 消化的 末端连接示意图
酶切反应的基本步骤

CK T M CK T M
加反应液
37℃ 1h
电泳
紫外分析
+ Buffer (10 ) (10×) ddH2O DNA Enzyme Volume 2.0 µL 约16.5 µL 0.2~1.0 µg 1~2U 20.0 µL
1.0kb 1.0kb 0.6kb 0.5kb 0.4kb
识别与切 分别,随机切割, 同一位点 割位点 相距较远 在基因工 程中意义 无用 非常有用
限制性核酸内切酶的类型
主要特性 限制修饰 蛋白结构 I型 多功能 异源三聚体 II 型 单功能 同源二聚体 III 型 双功能 异源二聚体 ATP Mg2+ 辅助因子 ATP Mg2+ SAM Mg2+ SAM GAGCC CAGCAG
生产厂家提供限制性内切酶时,包装中会附赠 该酶的最适10×反应缓冲液。 有些酶可在几种缓冲液中发挥最大活性,有些 酶必须要在该酶特定的缓冲液中才能发挥最大活 性。有些酶在某些缓冲液中会出现星号活性。 生产厂家的目录中会提供不同缓冲液中酶活力 的详细信息。
(四)限制性内切酶反应温度 四 限制性内切酶反应温度 大多数酶的最佳反应温度为37°C,也 有的高于或低于此温度。
EcoR I
5’…… G A A T T C ……3’ 3’ ……C T T A A G ……5’
HindⅢ切割位点 Ⅲ
DNA
HindⅢ Ⅲ
AA G C T T T T C G AA
DNA
A
B
A AGCTT TTCGA A
C
D
核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用
限制性核酸内切酶的切割类型: • (1)两条链上的断裂位置是交错和对称围 绕着一个对称轴排列,这种形式的断裂结 果形成具有粘末端的DNA片段; • (2)两条链上的断裂位置是处在一个对称 轴的中心,这样形式的断裂是形成具有平 末端的DNA片段。
一、限制性内切酶的命名和种类
命名: 命名:以微生物属名第一个字母和种名前 两个字母命名,后面加菌株代号的一个字母。 两个字母命名,后面加菌株代号的一个字母。 如果从同一菌株分离到多种酶, 如果从同一菌株分离到多种酶,则依次用罗 马数字I、 、 、 来表示 来表示。 马数字 、II、III、IV来表示。 前三个字母用斜体,其他字母用正体。 前三个字母用斜体,其他字母用正体。
• 3’粘性末端(如Pst Ⅰ) 粘性末端( 粘性末端
同裂酶和同尾酶
同裂酶isoschizomers :来源不同的限制酶识别相同的 来源不同的限制酶识别相同的 核苷酸靶序列。产生同样的切割,形成同样的末端。 核苷酸靶序列。产生同样的切割,形成同样的末端。 如:HpaⅡ和MspⅠ均可切割 Ⅱ Ⅰ均可切割C↓CGG。 。 当胞嘧啶甲基化后, 当胞嘧啶甲基化后, MspⅠ不能再切割。 Ⅰ不能再切割。 同尾酶isocaudamers :来源不同,识别的核苷酸靶序列 来源不同, 来源不同 也不相同,但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限 也不相同,但切割后 分子产生的粘性末端相同的限 制性核酸内切酶。 制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一 、 和 组同尾酶。 组同尾酶。 注意:由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接, 注意:由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接, 但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片 段将不能被该两种酶的任一种所识别。 段将不能被该两种酶的任一种所识别。
3’ XXXXCCTAG
3’ XXXXTCTAG
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