新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研修订版IBMT standardization office【IBMT5AB-IBMT08-IBMT2C-ZZT18】新生儿促甲状腺素的时间分辨荧光免疫分析及其试剂盒研制 谭玉华，冯健明，卢顺舵，罗建安，李建国，季涛，李贵情（广州市丰华生物工程有限公司，广州 510730 ）摘要：目的利用时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）技术，建立新生儿促甲状腺素（Neonatal TSH）微量检测法，并研制其检测试剂盒。
方法采用了一株TSH单克隆抗体用于固相包被，另一株TSH单克隆抗体用于标记铕（Eu3+），固相双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法检测Neonatal TSH。
结果自建的Neonatal hTSH TrFIA法灵敏度高可达2.28μU/ml，且在测量范围内，自制试剂盒剂量-反应曲线的相关系数r达0.9987。
与hLH、hFSH、HCG无明显交叉反应。
分析内或分析间质控结果在靶值±25%内，室内低质控、高质控分析内和分析间变异系数(CV)分别为7.12%和6.09%，7.82%和7.03%。
与DELFIA ? Neonatal TSH试剂标准品进行准确性比对实测值与标示效价比平均值为1.05。
与DELFIA ? Neonatal TSH试剂比对试验符合率一致，相关性系数r可达0.9822。
试剂盒室间质评能力比对成绩100%。
结论自建的Neonatal TSH TrFIA法具有灵敏度高，特异性强，准确度高，精密性好和非放射性等优点，具有良好的临床应用价值。
?基金项目：科技型中小企业技术创新基金（08C26114411281），广州市科技计划项目（2006V42C0051）。
作者简介：谭玉华，1980年10月，男，医学学士，检验技师，主要从事标记免疫试剂的研发、应用和医学检验工作。
Email:tanywhy@关键词：新生儿；促甲状腺素；时间分辨荧光免疫分析Time-resolved Fluoroimmunoassay of Neonatal Hypothyropin and Preparation ofIt’s Test ReagentTan Yu-hua,Feng Jian-ming, Lu Shun-duo, Luo Jian-an, Li Jian-guo, Ji Tao,LiGui-qing( Guang zhou Fenghua Bio-engineering Co.,LTD,Guangzhou 510730 China) Abstract:Objective To establish a method of Time-resolvedFluoroimmunoassay(TrFIA) for the quantitative determination of human thyroid stimulating hormone(hTSH) in blood specimens dired on filter paper as an aidin screening newborns for neonatal hypothyroidism,and to prepare it’s test reagent .Methods The method based on solidphase sandwich TrFIA for Neonatal Hypothyropin(Neo-hTSH),which used two anti-TSH monoclonal antibody -one was coated on microplates and another was labeled by Europium. Results The assay sensitivity of the method was 2.28μU/ml.The correlation coefficient of self made kit’s curve was 0.9987.There was no obvious cross-reaction to human luteinizing hormone(hLH) , human follicle stimulating(hFSH) and humanchorionic gonadotropin(HCG).The intra-assay and the inter-assay measuredvalues of controls were not more than 25% difference from their labeled values, still their intra-assay and the inter-assay coefficients of variation(CV) of low and high controls were 7.12% and 6.09%, 7.82% and 7.03%,respectively. The correlation coefficient of self made Kit and DELFIA ? Neonatal TSH kit was0.9822,and the results of self made Kit and DELFIA ? Neonatal TSH kit were showing no difference. The lab’s proficiency testing was excellent. Conclusions The Neonatal TSH TrFIA established which has several advantages including high sensitivity, strong specificity, good accuracy, nice precision, and non-radioactive immunoassay. It is suitable for clinical use.Key words: Neonatal; Hypothyropin; Time-resolved Fluoroimmunoassay 新生儿血液中促甲状腺素（Neonatal TSH）浓度升高(出生72小时后采血)是原发性甲状腺功能低下症（CH）最早的实验指标。
CH是造成儿童智力低下和生长发育迟缓的重要疾病之一。
通过新生儿筛查，可及早诊断和阻断疾病发展，预防脑损伤的发生。
国内由于筛查技术的滞后，新生儿疾病的筛查尚待普及。
国内外资料表明开展和推广新生儿疾病的筛查，其经济意义和社会意义日益显着。
随着《中华人民共和国母婴保健法》的颁布，对依法进行新生儿疾病筛查提供了有效的法律和政策支持。
并且TrFIA法为卫生部新生儿疾病筛查质控中心推荐的首选方法[1]。
经过多年研究，我们建立了Neo-hTSH TrFIA法，并研制出了诊断试剂盒，现报道如下。
1 材料与方法1.1 标本标本均在受试者知情同意下通过S&S903滤纸收集，严格按要求操作[2-4]，由郑州大学第三附属医院、沈阳市妇幼保健所新筛中心、佛山市顺德区妇幼保健院提供。
1.2 材料与仪器分别用于包被和标记的两株鼠源性促甲状腺素单克隆抗体（进口分装），TSH纯品、牛血清白蛋白（BSA）和Tween80（Sigma公司）。
Sepharose CL-6B （Pharmacia公司）。
96孔微孔板（Thermo Labsystems公司）。
铕(Eu3+)标记试剂盒（Wallac公司）。
β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分的Eu3+发光增强液[5]、洗涤液[6]和含有小牛血清(200ml/L)的50mmol/L pH7.80Tris-HCl溶液为分析缓冲液[6]均为自制。
其余试剂2D1420型为国产分析纯试剂。
冻干机（上海浦东冷冻干燥设备有限公司）。
VictorTMTrFIA检测仪及配套DELFIA ? Neonatal TSH试剂（Perkin Elmer公司）。
恒温振荡仪（广州丰华公司）。
1.3 标准血片、质控血片制备用TSH纯品按50-55%的血细胞比容由人全血制备，由本公司生产部提供。
1.4 固相抗体包被板的制备将包被抗体用50mmol/L pH4.6柠檬酸缓冲液稀释至3.00μg/ml，在96孔微孔板各孔中加200μl，4℃过夜，弃去包被液，洗涤1次，每孔加280μl含有10.0g/L BSA的10mmol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，37℃封闭2h，弃去封闭液，真空抽干过塑冷藏。
1.5 铕标记物的制备将1mg的标记抗体加入含有1mg的Eu3+冻干粉小瓶中，室温振荡反应48h。
反应液经用50mmol/L pH7.80Tris-HCl缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱（1cm 监测收集第一洗脱峰。
×40cm）层析，A2801.6 建立Neo-hTSH TrFIA检测方法采用双抗体夹心法，将标准品、质控品或样本用打孔器打下直径约3.2mm样品盘于固相抗体包被板中，再加入用分析缓冲液1：1200稀释的铕标记物 200μl室温振荡4h（室温法）或室温振荡15min后置于4℃过夜孵育再室温振荡1h（过夜法），洗涤6次，加入增强液200μl ，振荡5min后，于1420时间分辨仪上用随机配备的Workstation软件荧光计数和用Multicalc软件进行拟合分析。
1.7 Perkimelmer公司DELFIA ? Neonatal TSH检测方法严格按仪器和试剂说明书操作检测。
1.8 评价参数评价试剂盒的分析灵敏度、分析特异性、准确性、精密度，建立试剂盒的参考值，并与国外同类产品进行比对试验。
1.9 统计学处理 Neonatal TSH TrFIA标准曲线分析（有效剂量（ED）、变异系数（CV）等）及结果由Victor TM2D1420仪随机配备Multicalc软件自动给出。
其它平行对照实验均采用配对t检验分析或直线相关性分析。
测试值与靶值间采用偏倚分析。
2 结果2.1 上述包被抗体浓度、包被与封闭温度与时间[7]、反应温度与时间[7-8]、铕标记物工作浓度、洗板次数等均采用棋盘方阵滴配法确定。
2.2 方法学评价参数2.2.1 剂量反应曲线采用LIN-MEAS拟合模式，绘制标准曲线如图1。
在测量范围内，自制试剂盒剂量-反应曲线的相关系数r达0.9987。
图1 自制试剂盒剂量-反应曲线2.2.2 分析灵敏度以自制试剂1 μU/mL全血标准品重复检测20次，以x +2s的荧光值在曲线上得到相应浓度为检测低限，则本方法的检测低限可达2.28μU/ml。