• 纸片扩散法 –Rosco纸片扩散法
CLSI真菌药敏标准文件
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关联文件
M27-Ed4 2017.11 酵母菌肉汤稀释法药敏试验标准方法
M60
M27-S4
酵母菌肉汤稀释法药敏试验参考标准
废止
M38-A3 2017.11 丝状真菌稀释法药物敏感试验的参考方法
M61
M44-Ed2 2009.08 酵母菌纸片扩散药敏试验方法
7% 27%
40%
12% 14% 真菌药敏送检量
2508
13%
54%
16% 4% 13% 真菌血清送检量
4592
1万例以上 1000-9999例 100-999例 1-100例 0例
数据尚未发表
抗真菌药物
分类 多烯类
咪唑类
第一代 第二代
唑类（吡咯类）
三唑类
第三代 新一代
嘧啶类
丙烯胺类
胞嘧啶
棘白菌素类
菌株分类 非皮肤霉菌
皮肤霉菌
培养基 0.2%/2%葡糖 RPMI 1640, 0.165mol/L MOPS, pH 7.0±0.1
• PDA 35℃ 培养条件 • 毛霉目、曲霉48h；
• 镰刀菌35℃ 48~72h + 25~28 ℃至7d
接种量 0.5×104~5×104 CFU/ml
•PDA；燕麦琼脂（仅红色毛癣菌) •30℃ 4~5d 至产孢良好
酵母菌微量肉汤稀释法
• 改良培养基
– 含2%葡萄糖的RPMI, 0.165mol/L MOPS, pH 7.0 – 含MOPS的酵母氮的基础肉汤（新型隐球菌）
• 菌株传代
– 沙保弱培养基(SDA)或土豆培养基(PDA)，35℃ – 念珠菌 24h，隐球菌 48h
• 挑取菌落
– 0.5麦氏浊度（1~5×106CFU/ml）
1×103~3×103 CFU/ml
• 链格孢属 30℃； • 其它35℃。 孵育条件 • 根霉21~26h； • 镰刀菌属、曲霉属、申克氏孢子丝菌
46~50h • 赛多孢属 70~74h
• 35℃ • 培养至产孢良好
丝状真菌悬液制备
• 接种物
– 分生孢子或孢囊孢子菌悬液0.4×104~5×104 CFU/ml
M60
M44-S3
酵母菌纸片扩散药敏试验抑菌圈判断标准，MIC折点解释标准和质量控制 废止
M51-A 2010.05 非皮肤来源的丝状真菌纸片扩散法药物敏感试验方法
M61
M51-S1
丝状真菌纸片扩散法药物敏感试验判读标准和质量控制
废止
M57-Ed1 2016.04 建立抗真菌药物流行病学折点的原理和方法
Байду номын сангаас
基本概念
最低抑菌浓度 MIC
• 抑制菌的生长至特定程度的最低药物浓度。
最低有效浓度 MEC（曲霉-棘白菌素）
• 能够导致菌丝形成小的、圆形的、紧凑的菌丝颗粒的最低药物浓度
最低杀真菌/致死浓度 MFC
• 从显示完全抑制生长的每个MIC孔中取混悬液转种于琼脂培养基 • 真菌不生长或3~5个菌落生长的最低药物浓度
真菌药敏试验规范化操作
真菌亚专业分组与独立真菌工作区域
348家三甲综合医院真菌检测现状调研
真菌亚专业分组
(n=348)
28% 72%
有真菌亚专业分组 无真菌亚专业分组
有独立真菌工作区域医院的比 独立真菌工作区域面积 例
41%
59%
2 8平方 米
有独立真菌工作区域 无独立真菌工作区域
20%
80%
有独立真菌工作区域 无独立真菌工作区域
代表性药物 两性霉素B
咪康唑 酮康唑 氟康唑 伊曲康唑 伏立康唑 泊沙康唑 氟胞嘧啶 特比萘芬 卡泊芬净 米卡芬净 阿尼芬净
真菌药敏试验方法
• 微量肉汤稀释法
• 商品化微量肉汤稀释法 –ATB Fungus 真菌药敏试条 –Sensititre® YeastOne™比色法真菌药敏板
• 浓度梯度法 –Etest 真菌药敏试条
• 接种量
– 0.5~2.5×103CFU/ml / 0.5~2.5×105CFU/ml
• 孵育条件
– 35℃ 24h – 如生长对照孔生长较弱，延长培养至48h
微量肉汤稀释法
• 结果判读： • 两性霉素B：100%抑制 • 唑类、5-氟胞嘧啶、棘白菌素类：50%抑制
酵母菌结果判定-M60
丝状真菌肉汤稀释法
• 诱导产孢
– 大部分菌PDA 35±2⁰C 7d或至产孢良好 – 毛霉和曲霉48h，镰刀菌属35±2⁰C 48~72h然后28~30±2⁰C培养到7天。
• 1 ml 0.85%盐水，±1滴 or 0.01 ml吐温20，尽量去除菌丝片段。 • 静置3~5 min，取上清转移至无菌管，振荡15s • 使用光线路径1 cm比色杯，测定530 nm光密度： • 曲霉、拟青霉 0.09~0.13， • 镰刀菌、毛霉、波氏假阿什利霉、多育赛多孢 0.15~0.17， • 链格孢、离蠕孢 0.25~~0.3 • 悬液1:50稀释，达到最终要求浓度的2倍
M59
M59-Ed2 2018.01 抗真菌药物敏感性流行病学折点
M57
M60-Ed1 2017.11 酵母菌药敏试验参考标准
M27&M44
M61-Ed1 2017.11 丝状真菌药物敏感试验标准
M38&M51
EUCAST真菌药敏文件
• E.DEF 7.3.1 酵母菌肉汤稀释法 • E.DEF 9.3.1 产孢丝状真菌肉汤稀释法 • ECUAST推荐抗真菌药物敏感性日常及扩展的内部质控 • EUCAST临床折点依据，11个文件 • EUCAST技术说明，9个文件 • 真菌临床折点V8.1 • 免费英文版 • ChiCAST官方中文版
20 平方 米
数据尚未发表
2017年全年真菌检测送检量
348家三甲综合医院真菌检测现状调研
真菌检测各项目各数量级送检量的医院比例
(n=348)
100% 80% 60% 40% 20% 0%
平均送检量
15%
59%
18% 35% 真菌涂片送检量
5180
21%
48%
23% 53% 真菌培养送检量
7022
基本概念
临床折点 CBP
• 可将菌株分为：敏感，剂量依赖性敏感，中介，耐药或非敏感
流行病学界值 ECV
• 可区分具有/不具有耐药表型菌群的MIC或纸片法直径 • 可将菌株分为野生型（WT）与非野生型（NWT） • Vs. CBP: 仅根据体外数据建立
剂量依赖性敏感 SDD
• 通过提高剂量来达到高于正常血药浓度的目的 • 目前抗真菌药物仅用于氟康唑