大肠菌群的检测：旧国家标准------三步法
乳糖发酵试验 分离培养 证实试验
被检样品
图 大 乳糖胆盐发酵管3537 肠 ℃ ，242小时 菌 群 不产气 产气 检 验 伊红美蓝或远藤或麦 程 大肠菌群阴性 康凯平板任意一种， 序
报告
稀释
35 37 ℃ ，18 24小 时
挑可疑菌落1-2 个同时进行 革兰氏染色 乳糖发酵管3537 ℃ ，242小时
稀释液的选择

样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用 磷酸盐缓冲液（或0.1%蛋白胨水），后者对 食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用 。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀 释，可以采用灭菌蒸馏水。
培养条件
培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其 生活环境水温较低，故多采用30℃） 培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即 可计数 培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后， 培养基失重不应超过15％ 在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清， 可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培 养后菌落呈红色，易于分别

不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平 板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍 数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（ 有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检 样计数报告的依据。

当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明 显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则 每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开 计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不 到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘
－计数报告。
GB中国国家标准 SN 中国源自验检疫行业标准 FDA BAM(Bacteriological analytical manual) 美国食品药品管理局细菌学分析手 册 ISO(International Organization for Standardization )国际标准化组织 AOAC国际分析化学家协会

细菌总数的常规检验方法
稀释平板菌落计数法(Plate Counter)
操作步骤
-----样品的稀释 -----倾注平皿 -----培养48（24）小时 -----计数 -----报告
25g或25mL
1mL
9mL
10-1
225mL
10-2
10-3
10-6
10-7
无菌生 理盐水
稀释平板菌落计数法
ＥＭＢ培养基成分
肉汤蛋白胨培养基１００毫升（Ｐh７.６）， ２０％乳糖溶液２毫升，２％伊红溶液２毫升， ０.５％美蓝溶液１毫升。
ＥＭＢ配制方式
将已灭菌的肉汤蛋白胨琼脂培养基熔化
以无菌操作加入预先灭菌的２０％乳糖溶液 ２毫升、２％伊红溶液２毫升及０.５％美蓝溶 液１毫升。
ＥＭＢ培养结果观察
大肠杆菌的菌落在透射光下呈紫黑色，在反 射光下常常有一种金属光泽（亮绿色） 产气杆菌以粘质状菌落丰盛地生长，呈棕色
指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需 氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢的杆菌。 包括埃希氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属和克雷 伯氏菌属等的一些菌种。
分布广泛：土壤、人和动物肠道。
大肠菌群MPN值
指每1g或1ml食品检样中大肠菌群最可能数 （most probable number）。
大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示 的卫生意义：
若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300， 则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告 之。 如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘 稀释倍数报告之。 如菌落数有的大于300，有的又小于30，但 均不在30~300之间，则应以最接近300或30的 平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘 以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情 况计算出的菌落数按估算值报告。
螺旋平板仪
粪便污染指示菌类
理想的指示菌应具备的性能
必须与粪便或病原菌有密切关系。它们正常寄 居场所应是人或动物的肠道，在正常情况下不应 在一般检样中存在。 在普通培养基上易生长，用简单的操作方法即 能快速和准确地测定出数量。 它们与肠道致病菌应有相同的对外界不良因素 的抵抗力。
粪便污染指示菌之一

单位——菌落形成单位叫做CFU（colony forming units）
菌落总数所指示的食品卫生意义 ：
它可以作为食品被污染程度的标志，一般食 品中菌落总数越多，则表明该食品污染程度越 深。 它可以用来预测食品存放的期限或程度。
检测方法与步骤

平板菌落计数法 基本操作一般包括： 样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－
方法优点
方法简便，较精确，重复性好。
细菌总数的其它检验方法
涂布平板法 点滴平板法 螺旋平板法：螺旋平板法是由 一台机器完成的。
涂布平板法
是将营养琼脂制成平板、经50℃1—2小时或
35℃18～20小时干燥后，在上面滴加检样稀释液
0.2ml，用“L”棒涂布于整个平板的表现，放置约
10分钟，将平板翻转，放至36+1℃温箱内培养
大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌 落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌
群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100
个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证 实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为： 100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。

选取菌落数在15 CFU～150 CFU 之间的 平板，分别计数平板上出现的典型和可疑 大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆 盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。
大肠菌群在VRBA上的菌落特征
证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可 疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
革兰氏阳性
革兰氏阴性 无芽孢杆菌
产气
不产气 大肠菌 群阴性
大肠菌群阴性 大肠菌群阳性
报告
报告
报告
产气实验
ＥＭＢ（伊红美蓝） 琼脂培养基原理
ＥＭＢ琼脂培养基中含有的伊红和美蓝染料， 可抑制革兰氏阳性细菌。那些能发酵乳糖的细 菌，能将染料摄入细胞，从而使菌落呈现出紫 色或边缘无色、中央暗黑色的菌落。
食品卫生微生物学指标
食品卫生标准
是检验食品卫生状况的依据，包括 感官指标 指通过目视、鼻闻、手摸和口尝检 查各种食品外观的指标，一般包括 色泽、气味、口味和组织状态等。 指食品在原料、生产、加工过程中 带入的有害物质以及由于霉变和腐 败变质而产生的有毒有害物质。
理化指标
微生物指标
目前实际应用的指标菌可以分为以下三种：
24±2小时，（水产品用30C培养48±2小时)取出， 进行菌落计数，然后乘以5(由0．2ml换算为1ml)， 再乘以样品稀释液的倍数，即得每克或每升检样 所含菌落数。
涂布法优缺点
比常规检验法效果好。因为菌落生长在表 面，便于识别和检查其形态，虽检样中含有 食品颗粒，也不会发生混淆．但是本法取样 量比常规检验法少。
一、一般卫生状况指标菌，包括菌落总数、
霉菌和酵母菌总数；
二、粪便污染指标菌，包括大肠菌群、粪大
肠菌群、大肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌、 霍乱弧菌等；
三、致病菌，包括金黄色葡萄球菌、链球菌、
沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌等。
食品卫生标准中的微生物指标
菌落总数
1.1菌落总数概念和其所指示的卫生意义
M
P N
计
数 法 检 验 程 序
查MPN 表
报告结果
大肠菌群计数方法：国家标准法
方法二----大肠菌群平板计数法： 样品稀释 平板计数典型和可疑菌落数 证实试验
图 大 肠 菌 群
检样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质 10 倍系列稀释 选择适宜3 个连续稀释度的样品匀液，接种VRBA 平板 36 ℃ ±1 ℃ 18 h ～ 24h
平板计数琼脂培养基（PCA）

胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄
糖1.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，

pH7.0±0.2, 121℃15分钟灭菌。
计数原则
到达规定培养时间，应立即计数。如果不能 立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超 过24h。 中国国家标准 GB 计数时应选取菌落数在 30 － 300cfu/g 的平板（ SN 检验检疫行业标准要 求为25~250cfu/g）。 若有二个稀释度均在30－300之间时，按国家 标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或 等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有 的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。
大肠菌群
------大肠菌群(coliforms)
一、大肠菌群(coliforms)的定义 二、大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示的 卫生意义 三、大肠菌群计数方法：国家标准法 （一）大肠菌群MPN计数法
（二）大肠菌群平板菌落计数法
大肠菌群(coliforms)的定义 大肠菌群
具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。
菌落总数
指食品检样经处理，在一定条件下培养后， 所得1g食品或1mL食品中或1cm2食品表面积 上所含有的细菌菌落总数。

一定条件：如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间
等

不能满足厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中
温的细菌的生长