分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。

2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。

3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。

4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。

5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。

其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。

该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。

提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA 多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。

少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。

细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。

在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。

当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。

这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。

溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。

由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。

质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

2.凝胶电泳进行DNA分离纯化：电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。

各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。

凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。

含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。

利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。

因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA 片段，是分子生物学的核心技术之一。

凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。

此外，凝胶中DNA 的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidium bromide，EB)或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。

需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。

分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝胶。

这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸(5—500bp)的分离和蛋白质电泳。

它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。

虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。

琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β-D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104-105。

琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40-45℃。

琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大(50至百万bp)，小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。

琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。

在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。

DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。

三、主要仪器和材料试剂：1.仪器和材料：恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，旋涡振荡器，水浴锅，1.5mL离心管，50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管等。

菌体：E.coli DH5α受体菌，具有Amp r标记的质粒pUC19。

2.实验试剂：LB培养基，抗生素（氨苄青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液（10×），上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭(EB),DNA相对分子质量标准物DNA Marker λ/Hind Ⅲ，5mol/L pH 5.2的醋酸钠。

四、实验步骤：1.菌体培养：（1）配制40mL液体LB培养基（加入5%葡萄糖）、100mL固体LB培养基、并准备足量的移液管、200μl微量移液器头、1000μl微量移液器头、50mL离心管、1.5mL离心管，灭菌备用。

（2）向液体LB培养基移取32μl氨苄青霉素，混合均匀。

（3）将提前活化的E.coli DH5α受体菌，接种于液体LB培养基中。

将锥形瓶放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min 培养12-16h 。

2.质粒DNA 的提取：（1）称量50mL 离心管重量W1，取30mL 菌液于已称重的50mL 离心管中，配平后6000r/min 离心5min 。

（2）弃上清，向离心管中加入5mL 溶液Ⅰ，涡旋振荡，6000r/min离心5min 。

（3）弃上清并称重W 2，求W=W 2-W 1。

（4）按照1.0mL/100mg 菌体的量加入溶液Ⅰ，充分涡旋振荡，冰浴5min ，再按照2.0mL/100mg 菌体的量加入溶液Ⅱ，温和颠倒混匀，冰浴2min ，然后再按照1.5mL/100mg 菌体的量加入溶液Ⅲ，温和颠倒混匀，冰浴10min ，平衡后12000r/min 离心15min 。

（5）取上清至新50mL 离心管内，记录体积，加入两倍体积的冰乙醇，混匀后在-20℃环境下保存30min 。

取出后12000r/min 离心15min ，弃上清，加入5mL70%乙醇，12000r/min 离心5min ，弃上清，加入5mL70%乙醇，12000r/min 离心5min ，弃上清，37℃放置5-10min 。

（6）取出离心管，加入1mLTE 溶液得到粗提物，加入RNase A 液，使溶液浓度为150μg/mL ，37℃保存60-120min 。

3.质粒DNA 的纯化：（1）取500μl 粗提物于1.5mL 离心管中，加入等体积的Tris 饱和酚，混匀，12000r/min 离心10min 。

（2）转移上清（体积V 1）至新管，加入等V 1的酚：氯仿：异戊醇溶液，混匀，12000r/min 离心5min 。

（3）转移上清（体积V 2）至新管，加入等V 2的氯仿：异戊醇溶液，混匀，12000r/min 离心5min 。

（4）转移上清（体积V 3）至新管，加入V 3的3M NaAc 溶液（pH5.2），110再加入2V 4（V 4=V 3+V 3）的冰乙醇，混匀，-20℃保存30-60min ，110取出后12000r/min 离心15min 。

（5）弃上清，加入500μl 70%乙醇，10000r/min 离心2min ，再加入500μl 70%乙醇，10000r/min 离心2min ，37℃保存5-10min 。

（6）取出离心管，向一只离心管中加入25μl TE 溶液，溶解沉淀后，转移入另一只离心管中，再取25μl TE 溶液加入第一只离心管中，溶解后再移入另一只离心管中，得到50μl 纯化质粒DNA 。

4.DNA 纯度检测：（1）取40mLTAE （1×）于300mL 锥形瓶中，加入0.4g 琼脂糖，放入微波炉内使其熔化，60℃时倒入准备好的制胶槽中。

（2）取5.0μl 纯化DNA 加入1.0μl 上样缓冲液，混合，进行点样。

（3）点样完毕后，100V ，200mA 条件下电泳30min 。

（4）电泳完毕后，进行EB 染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结果。

五、实验结果：凝胶成像仪拍照如下：1 2 3 4 5 6 7 8 9 10图1 DNA纯度检测凝胶成像结果（1号泳道：DNA marker λ/HindⅢ；2号泳道：超螺旋状态的pUC19质粒DNA；3号泳道：线性的pUC19质粒DNA；4号泳道：空泳道；5至9泳道：7至11组pUC19质粒DNA样品；10号泳道：λDNA）本组点样在第9泳道，照片显示各种杂质去除得较为彻底，得到了较高纯度的超螺旋状态的pUC19质粒DNA。

六、讨论：1.为获得高纯度的质粒DNA，必须彻底去除杂蛋白、染色体DNA和RNA。

在整个质粒提取过程中出去染色体DNA的关键步骤是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。

加入溶液Ⅰ时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；加入溶液Ⅱ时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留；加入溶液Ⅲ时，会立即出现白色沉淀。

加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在旋涡振荡器上剧烈振荡，否则染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。

因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。

2.酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。

皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。

3.为最大限度去除上清，可在倒掉部分上清后，再将离心管放入离心机稍作离心，使残留在管壁的液体集中到离心管底部，再用移液器移除液体。