• 既能在酵母菌中复制也能在 大肠杆菌中复制，所谓酵母 菌—大肠杆菌穿梭载体。
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YAC载体
首先用EcoRI和BamHI双 酶切割，获得均具 BamHI和EcoRI切割末端 的两个DNA片段(双臂) ，随后把两端具EcoRI 切割末端的外源DNA与 此双臂连接，构成酵母 人工染色体。用电激仪 把此人工染色体转化酵 母受体细胞。
Science Volume 355(6329):eaaf4704
March 10, 2017
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Synthetic Yeast 2.0
• Building the world‘s
first
synthetic
eukaryotic
genome
together！
Dr. Jef Boeke
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目录
synV设计原理 人工设计基因组原则 PCRTags 引入新序列 Cre-LoxP重组酶系统 组装
Cre-LoxP重组酶系统 Cre重组酶 于1981年从P1噬菌体中发现，基因编码区序列全长1029bp。 一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之 间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组
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Cre-LoxP重组酶系统
• Cre-LoxP重组酶系统 – LoxP（locus of X-over P1）序列：
删除
逆转录转座子
换位
Elements
替换
将TAG替换为TAA
引入
不变
Gene order
端粒重复部分 内含子
tRNA基因 部分同义密码子替换 LoxP Sym sites
PCRTags
Noncoding regions
• 利用密码子简并性实现
基本理念： 优化基因组，减少不稳定和冗余结构
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Isaacs, F. J. et al. Precise manipulation of chromosomes in vivo enables genomewide codon replacement. Science 333, 348–353 (2011).
（1）通过综合共转化 策略进行多重变异修 复
（2）通过综合共转化 策略成功校正变体的 实例。 通过单个共转 化过程，用loxPsym位 点替换tRNA基因和内 含子;
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引入新序列
• 在每个非必需基因前后加入了特殊序列 – LoxP Sym sites
• Cre-LoxP重组酶系统 – 特异性删除某特定序列的技术 – 在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基 因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。
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酿酒酵母简介
• 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
– 又称面包酵母或者出芽酵母 – 在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物
• Morganism – 发酵中最常用的生物种类。 – 细胞为球形或者卵形，直径5–10μm。 – 同时存在单倍体和双倍体(酵母的优势形态)。
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EcoRI CEN4
克隆位点以及可在细菌和酵 Apr 母菌中选择的标记基因。此
pYAC4
URA3
外，YAC还具有酵母菌染色
体的一些特点。可以接受
ori
100-1000kb的外源DNA片段。
TEL Bቤተ መጻሕፍቲ ባይዱmHI TEL
9
这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复 制形式进行高拷贝复制。 这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化 第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制 的形式进行复制和传递。
合成生物学(Synthetic biology)
1
1.人工合成酵母染色体 2.人工合成酵母基因组
2
3
4
酿酒酵母简介
• 酵母（Yeast）是一类种类繁多的生物资源，已知 有80个属约600多种，数千个分离株。
• 酵母是一类单细胞的真核生物。 – 它有完整的亚细胞结构和控制严密的基因表达调 控机制。 – 它既能通过有丝分裂进行无性繁殖 – 也可以通过减数分裂实现有性繁殖。
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酿酒酵母作表达系统的缺点
在YAC载体中的插入片段会出现缺失和重排的 现象。
容易形成嵌合体。即在单个YAC中的插入片段 由2个或多个独立的基因片段连接组成的现象。
YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近， YAC染色体转入酵母细胞后很难从中分离出来。
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人工合成酵母基因组
“Perfect” designer chromosome V and behavior of a ring derivative
• 不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的 菌落呈白色。
• 带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已 经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色 菌落。
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• 一般酵母表达载体都以大肠 杆菌质粒为基本骨架再加上 酵母的自主复制序列，选择 标记，外源基因插入位点， 启动子和终止子。
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⑤在两个末端序列中间，有 一段填充序列(HIS3)，以 便pYAC4在细菌细胞中稳定 扩增；
⑥Amp抗性及细菌质粒复制原 点；
⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该
位点位于酵母菌Sup4 tRNA 基因内。
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选择标记--Sup4
• Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色表型(成 为白色)。
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YAC载体--pYAC4
• 主要结构：
①两个可在酵母菌中利用的选择 基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基 因)； ②酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)； ③一个自主复制序列(ARS1)； ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的 末端重复序列(TEL)，以保持重组 YAC为线状结构；
• Cre-L•ox来P重源组于酶P1系噬统菌体 – 如果• 两有个两L个ox1P3位bp点反分向别重位复于序两列条和不中同间的间D隔NA的链8或bp染序色列体上 ，Cre共酶同能组介成导，两8条bpD的NA间链隔的序交列换同或时染也色确体定易了位L。oxP的 方向。 • 13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。
筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性 选择标记；
筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营 养缺陷型。
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人工酵母染色体克隆载体的构建
YAC(酵母人工染色体)克隆载体是最早构建成功 的人工染色体克隆载体。
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)以及必要的选择标记(HISA4和 TRPl)基因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，构建 成YCA克隆载体。
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synV设计原理
synV设计期间的主要编辑包括删除两个亚端粒区域，20个tRNA基因， 30个转座子/ Ty元件和10个内含子，并插入176个loxPsym位点; 额外 的基因变化包括62个TAG / TAA终止密码子互换和339个同义重新编码， 以引入源自天然染色体V的PCRTag
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人工设计基因组原则
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小片段组装大片段
F 1
模板 1
PCR
R1
F2
模板
2
PCR
R2
片段 A
F 1
无引物 PCR
互为模板、 引物延伸
延伸PCR
片段B R2
目的片段
搭桥PCR的原理示意图
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组装、整合
利用酵母自身的同源重组系统将小片段组装成大片段 利用大片段之间的重叠区域和同源臂可以将多个大片 段同时替换大片段的天然染色体
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敢想、敢做、能做！
Nothing is impossible!
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人工合成酵母染色体
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目录
酵母人工染色体载体 克隆载体的构建 YAC载体详述 选择标记--Sup4 酿酒酵母作表达系统的缺点
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酵母人工染色体载体
酵母人工染色体(yeast
artificial chromosome，
ARS1
YAC)是一类酵母穿梭载体。 TRP1
YAC具有自主复制序列、
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PCRTags
PCRTag的开放阅读框（ORF）内的短重新编码序列促进了基于聚合酶链反应（PCR） 的测定法，以区分野生型与合成DNA。
PCRTag分析是确保synV并入成功的主要支柱。 选择具有正确的营养缺陷型和与 野生型菌株（BY4741）相似的适应性的中间菌株用于基因组DNA（gDNA）提取和 PCRTag分析。