1 抗虫基因的主要种类
1.1 苏云金杆菌 Bacillus thuringiensis, Bt 蛋白基因
1911 年贝利纳 E. Berliner 于德国苏云金杆 地区的地中海粉螟 Anagastra kuhniella 中发现而 得名为苏云金杆菌 苏云金杆菌在繁殖发育过程中
产生伴胞晶体 它由一种或几种称为 ä-内毒素 ä-endotoxin 或杀虫晶体蛋白 insecticidal crystal
proteins, ICPs 的亚单位组成 Bt 伴胞晶体在靶标 昆虫高 pH 值的中肠环境中溶解 释放出一种或几 种杀虫晶体蛋白 也称 ä-内毒素或原毒素(protoxin) 经蛋白酶水解活化成更小的毒性多肽 smaller toxic polypeptide 即活化毒素 activated toxin 能特 异性地与肠壁细胞膜上的受体位点结合 破坏肠壁 细胞的渗透平衡 使之生化代谢和生理功能失调 细胞肿胀裂解 幼虫停止取食 最终死亡
1992 年 报道了一类新基因 即 CryV 类 特异 地抗鞘翅目和鳞翅目昆虫 后来 Schnepf 等根据 晶体蛋白基因 编码 Cry 和 Cyt 蛋白 的核苷酸序 列又将种类增加至 100 种以上
目前已发现 Bt 对节肢动物门的鳞翅目 双翅
收稿日期 2004－02－19 修回日期 2004－05－15
国内外对转 Bt 基因棉的抗虫性测定方法的研 究均有许多报道 但尚未建立统一的标准 缺少系 统的比较研究 孟凤霞等 2000 年 自 1996 年开 始 对转 Bt 基因棉叶片和蕾的抗虫性测定方法进行 了系统研究 建立了一套比较简单可行的生测方法 与澳大利亚 Fitt 等 1994 年 建立的抗虫性评价方 法基本一致[11-12]
基因类别 寄主范围 1 氨基酸数目 预测的摩尔质量 kDa
CryIA(a)
L
1176
CryIA(b)
L
1155
CryIA(c)
L
1178
CryIB
L
1207
CryIC
L
1189
CryID
L
1165
CryIIA
L/D
633
CryIIB
L
633
CryIIIA
C
644
CryIVA
D
1180
CryIVB
D
1136
2.2 转 Bt 基因棉的抗虫性
2.2.1 对靶标害虫的抗虫性 自 1987 年美国 Agracetus 公司首次报道将外源
Bt 杀虫毒蛋白基因转入棉花后 经过 Monsanto 公 司的进一步研究和改进 成功地培育出了多个转 Bt 基因抗虫棉品种 并于 1996 年开始在美国和澳大利 亚进行大面积商品化应用 1997 年美国孟山都公司 新棉 33B Bollgard® 表达 Cry1Ac 开始在我国河 北省大面积推广种植 国内中国农科院生物技术研 究中心 江苏省农科院经作所 山西省棉花研究所 及中国农业科学院棉花研究所等将外源 Bt 基因转 入棉花 成功地培育出了多个转基因抗虫棉品种 并于 1998 年开始进入商品化生产
1989 年 Hofte 和 Whiteley 根据已报道的 42 个 Bt 晶体蛋白基因的核苷酸序列及其寄主范围进 行系统命名和分类 先按照相同或几乎相同序列合 并的原则 把已测序的 Bt 毒素蛋白分为 14 类晶体 蛋白基因 表 1 其中 13 类归属为 Cry 晶体蛋白 基因 又根据这些编码蛋白结构相似性和杀虫谱 将其分为 4 大类和若干小类 CryI 编码的晶体蛋白 具有抗鳞翅目昆虫的活性 CryII 抗鳞翅目和双翅 目 CryIII 抗鞘翅目 CryIV 抗双翅目 还有 1 种 从苏云金杆菌以色列变种 Bt subsp. israelensis 分 离出来 它不仅抗双翅目昆虫 而且对无脊椎动物 也有毒性 同时此基因在结构上与其它 13 种 Bt 毒 素基因 基因家族 无任何相关性 因此被命名为 CytA cytolytic crystal protein gene [8] Tailor 等
关键词 转基因作物 抗虫基因 抗虫性
DNA 重组技术或基因工程被认为是 20 世纪分 子生物学的一项最伟大的成就 1983 年第一株转基 因植物诞生 1987 年比利时植物遗传系统公司首次 报道了转 Bt 基因烟草 随着生物技术研究的迅速发 展 各国政府和有远见的企业加大了农业生物技术 的投资 1986 年美国和法国首先在田间进行耐除草 剂作标记基因的转基因烟草田间试验 由此至 1997 年的 12 年间 全球大约进行了 25 000 次转基因作 物的田间试验 涉及 10 个国家 60 种作物 10 个 性状 1999 年全球主要转基因作物种植面积达3 990 万 hm2 其中具有抗虫性状基因的作物约占 22% 具有抗虫和耐除草剂叠加基因的作物约占 7% 截 止 2000 年 全球共有 13 个国家允许播种转基因作 物 田间试验的转基因植物已超过 500 多种 美国 是转基因农作物种植面积最大的国家 占全球的 70% 其次为阿根廷 14% 和加拿大 9% 中 国位居第四 3% 按世界转基因作物种类分布是 大豆面积最大 占 53% 玉米 27% 棉花 9% 油 菜 8% 烟草 2% 土豆 0.1%[1] 国内外许多研究表 明 具有抗虫性转基因作物对目标害虫都有明显致 死作用和生长发育抑制作用[2-7] 不同学者从不同角 度采用不同方法对转基因作物抗虫性进行了鉴定
第3卷 第3期 2004 年 6 月
专论与综述
现代农药 Modern Agrochemicals
转基因作物的抗虫性
Vol.3 No.3 Jun. 2004
沈晋良 周晓梅
南京农业大学农药科学系 农业部病虫害监测与治理重点开放实验室 南京 210095
摘 要 介绍了转基因作物的抗虫基因种类 如苏云金杆菌蛋白基因 蛋白酶抑制剂基因和其 它抗虫基因 论述了转 Bt 基因棉 转基因玉米和其它转基因作物的抗虫性及其鉴定技术
作者简介 沈晋良 1942
男 教授 主要从事杀虫剂毒理与害虫抗药性教学与研究工作
万方数据
2
现代农药
第3卷 第3期
目 鞘翅目昆虫以及原生动物门 螨类 扁形动物 门等类群中的一些种类有活性 并从中分离到 180 多个杀虫蛋白基因 根据基因产物的同源性大小将 其划分为 28 群 其中来自我国的基因有 cry1Ac10
CryIVC
D
675
CryIVD
D
643
CytA
D/cytol.
248
133.2 .8 73.1 134.4 127.8 77.8 72.4 27.4
1. 专一的寄主范围 L 为鳞翅目 D 为双翅目 C 为鞘翅目 cytol. 为细胞溶解的和溶血的
Bt 最初为昆虫病原菌 杀虫活性大部分或全部 是伴胞晶体作用的结果 这导致了发展 Bt 生物农药 用于防治鳞翅目 双翅目 鞘翅目的害虫 最近报 道的分离物对其它目昆虫 如膜翅目 同翅目 直 翅目 食毛目 线虫 螨及原生动物有效 在农业 森林管理及蚊子防治中 Bt 已作为合成化学农药应 用的取代或补充 它也是植物中转基因表达抵抗有 害生物关键基因的来源
1.3 其它抗虫基因
除了上述几种主要抗虫基因外 还有植物凝集 素基因 淀粉酶抑制剂基因 几丁质酶基因 多酚 氧化酶基因 过氧化物酶基因 胆固醇氧化酶基因 及营养杀虫蛋白基因等 其中 凝集素是存在于植 物中的能够与糖类复合物上的糖基结合的蛋白质 目前发现它对同翅目 鞘翅目 鳞翅目及双翅目的 昆虫有毒性 可能是它影响了昆虫对营养物质的消 化吸收 从而导致昆虫饥饿甚至死亡 胆固醇氧化 酶是胆固醇代谢过程中的 1 个关键酶 能催化胆固 醇分解成 4-胆甾烯-3-酮和过氧化氢 胆固醇氧化酶 的杀虫谱相当宽 对鞘翅目 鳞翅目 双翅目 直 翅目和同翅目的害虫都有不同程度的作用 它能氧 化害虫生物膜上的胆固醇 在较低浓度时 能使害 虫的中肠纹缘膜受到破坏 在较高浓度时 能发生 完全的溶胞现象 从而膜的结构和功能都发生变化 以致引起害虫死亡 这一过程的生化机制目前还正 在研究 目前至少有 3 个胆固醇氧化酶基因已经被 克隆 其中 2 个来源于链霉菌 1 个来源于乳酸杆 菌 营养杀虫蛋白 vegetative insecticidal protein, Vip 是另一类高效杀虫蛋白质 目前已发现了 3 个 营 养 杀 虫 蛋 白 从 腊 状 芽 胞 杆 菌 Bacilluces cereus 培养物中分离出的 Vip1 Vip2 和从苏云金 芽孢杆菌培养物中分离出的 Vip3A 这类蛋白可能 与敏感昆虫表皮细胞 尤其是柱状细胞相结合 造 成细胞分解 伴随着肠道严重受损 受害昆虫迅速 死亡 昆虫摄食 Vip3A 与 Bt 毒蛋白致毒表症类似 但 Vip3A 发症时间要长些 目前 Vip3A 基因已获克 隆 对它的研究也比较深入 Vip3A 对鳞翅目昆虫 具有广谱抗虫性 尤其对小地老虎 粘虫及甜菜夜 蛾有显著杀虫效果[10]
虫具有良好的抗虫性 且呈明显的时空变化 即生 长前期抗虫性显著高于后期 营养器官高于生殖器 官 低龄幼虫死亡率明显高于高龄幼虫 Perlark 等
1990 年 将经过改造的 Bt Cry1A基因导入棉花 首次获得能高效表达杀虫蛋白的转基因棉花 随后 大量田间试验证明了这些转 Bt 基因棉花对烟芽夜 蛾 美洲棉铃虫 红铃虫均具有明显的控害作用[13]
1.2 蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor PI)基因
PI 是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一 是 植物天然抗虫物质 一般为 60~120 个氨基酸组成 的多肽 分子量约为 8~25 kD PI 基因的杀虫机理 在于它与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用 形 成酶 抑制剂复合物 enzyme-inhibitor complex EI 阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用 影响外来 蛋白的正常消化 同时 EI 复合物能刺激消化酶的 过量分泌 使昆虫产生厌食反应 最终造成昆虫的 非正常发育或死亡