实验一食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）
一、目的与要求
1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。

二、实验原理
1、消解：蛋白质是含氮的化合物。

食品与浓硫酸在催化剂作用下共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵而留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。

NH2(CH2)2COOH+13H2SO4=(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
浓硫酸将有机物炭化后为碳、氢与氮，将形成的碳氧化：
2H2SO4+C（Δ）=CO2+2H2O+2SO2↑
生成的二氧化硫将氧化态的氮还原为氨而自身被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸反应生成硫酸铵，
H2SO4+2NH3=(NH4)2SO4
在消解试验中，为了加速蛋白质的分解，缩短消解时间，常常加入下列物质：
（1）硫酸钾：一般浓硫酸的沸点为340℃，但加入硫酸钾后，硫酸不断分解，水不断溢出引起硫酸钾浓度不断增加，沸点因此而增加。

K2SO4+H2SO4=KHSO4
KHSO4（Δ）=K2SO4+H2O↑+SO3
但硫酸钾浓度不能太大，否则消化温度过高会引起铵盐的热分解而释放出氨，
（NH4）2SO4（Δ）=（NH4）2SO4+NH3↑
2KSO4（Δ）=2H2O+2NH3↑+2SO3↑
除了可以添加硫酸钾之外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等以提高溶液温度，但效果要差于硫酸钾。

（2）硫酸铜：硫酸铜可以催化反应。

可以采用的催化剂除了硫酸铜外，还可以加入氧化汞、汞、硒粉以及二氧化钛等，但考虑效果、价格以及污染等原因外，最常用的还是硫酸铜，同时可以加入少量的过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物的氧化，反应机理为：
2CuSO4（Δ）= Cu2SO4+O2↑+SO2↑
C+CuSO4（Δ）= Cu2SO4+CO2↑+SO2↑
H2SO4+Cu2SO4（Δ）= 2CuSO4+2H2O↑+SO2↑
此反应不断进行，如溶液没有褐色生成（Cu2SO4颜色）而呈现清澈的蓝绿色，说明有机物已经全部被消解完毕。

因此，在试验过程中，硫酸铜不但能够催化反应，而且能够指示反
应的进行程度。

2、碱化蒸馏：在消解完全的样品溶液中加入过量的浓的氢氧化钠溶液使溶液呈现碱性，加热蒸馏而放出氨气：
2NaOH+（NH4）2SO4（Δ）= Na2SO4+2H2O+2NH3↑
3、吸收与滴定：将加热蒸馏释放出来的氨利用硼酸溶液进行吸收，因硼酸属于弱酸，其后再用盐酸进行滴定：
2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl=2NH4Cl+4H3BO3
除此之外，也可以用过量的盐酸或者硫酸吸收整流而出的氨气，然后再用氢氧化钠进行回滴。

三、仪器与试剂
（一）试剂
1、硫酸铜（CuSO4·5H20）
2、硫酸钾
3、浓硫酸（密度为1.84g/ml）
4、硼酸溶液（20g/L）
5、氢氧化钠溶液（400g/L）
6、0.01mol/L 盐酸标准滴定溶液。

7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙醇溶液液：0.1%溴甲酚绿乙醇溶液=1:5。

（二）仪器
微量定氮蒸馏装置：凯氏烧瓶，如图所示。

四、实验步骤
1、样品消化
称取固体样品0.2-2.0g （半固体2-5g ，液体样品10-20ml ），移入洁净干燥的500mL 凯氏烧瓶中，加入0.5g 硫酸铜、5g 硫酸钾与10ml 浓硫酸，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，将瓶以45° 角斜支于有小孔的石棉网上，使用电炉，在通风橱中（不能瓶口对人）小火慢慢加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h ，取下放冷。

2、蒸馏与吸收
将凯氏定氮仪按图示连接，凯氏瓶中加入数粒玻璃珠（或沸石）以防暴沸，小心加10mL 水，放冷后再加入70ml 的NaOH 溶液，在吸收瓶中加入30ml 的硼酸吸收液并加入2-3滴混合指示剂，开始加热，打开冷凝水，设置蒸馏时间为210s 。

将冷凝管下端提离液面，并用蒸馏水冲洗管口。

3、将上述吸收液用0.1000mol/L 的盐酸标准溶液进行滴定，溶液由蓝色变为微红即为终点，记录盐酸用量。

做空白试验，记录相应消耗的盐酸体积。

五、结果计算
%1001000)((%)21⨯⨯-=F m
CM V V X 式中 X ——样品蛋白质百分含量（%）；
V 1——样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL ）；
V 2——空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL ）；
c ——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L ）
F 为氮换算为蛋白质的系数，0.1055mol/L
M 为氮的摩尔质量，14.0g/mol
计算结果保留三位有效数字。

六、注意事项及说明
1、消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。

可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。

2.消化开始时，不能用强火，应该慢慢加热，防止暴沸或样品粘附于瓶壁而消解不完全。

为此，消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。

3、若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。

4、蒸馏装置不能漏气，蒸馏完毕后，应将冷凝管下端提离液面并清洗管口，继续蒸馏一分钟后再停止加热，否则可能造成倒吸。

5、硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。

可把接收瓶置于冷水浴中。

6、混合指示剂在碱性条件下呈绿色，中性条件下呈灰色，酸性溶液中呈现红色。

七、思考题
1、预习凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作。

2、蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？
3、实验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些？。