1.基因诊断：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。

基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽2.基因诊断依据：①DNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；②基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。

3.基因诊断的特点：高特异性、高灵敏性、早期诊断性、应用广泛性4.基因诊断中常用的分子生物学技术：⏹核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）⏹聚合酶链式反应(PCR)⏹单链构象多态性（SSCP）：DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来⏹限制性片段长度多态性（RFLP）：由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。

⏹DNA序列测定（DNA sequencing）⏹生物芯片（biochips）⏹Western免疫印迹（Western blotting）⏹免疫组织化学诊断5.核酸分子杂交概念：以DNA的变性、复性为理论基础，指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程原理：在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)6.核酸分子杂交分类：Southern 印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交、反向斑点杂交、原位分子杂交、固相夹心杂交法7.基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。

8.基因治疗的策略：（一）基因置换：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。

目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。

基因同源重组技术又称为基因打靶:基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。

基因打靶原理:首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。

通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。

经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。

获得的带有特定修饰的突变动物提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能（二）基因添加：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。

（三）基因干预:采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。

（四）自杀基因治疗：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。

（五）基因免疫治疗: 通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。

9.基因治疗的技术应用：(一)遗传病基因治疗(二)恶性肿瘤基因治疗研究: 基因干预技术、自杀基因治疗、肿瘤的免疫基因治疗、提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；耐药基因治疗（三）病毒性疾病的基因治疗研究：调节机体免疫应答、抗病毒复制10.基因表达分析分为：封闭性系统研究方法:例如DNA微阵列、Northern印迹、实时RT-PCR等方法，其应用范围仅限于已测序的物种，只能研究已知的基因。

开放性系统研究方法: 如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现和分析未知的基因。

11.检测mRNA常用的实验方法及原理：（一）基于杂交原理的方法可检测mRNA表达水平1．Northern印迹：既可分析mRNA表达又可验证cDNA新序列，是一种基于RNA-DNA 杂交原理建立的一种RNA分析技术2.核糖核酸酶保护实验：可用于mRNA定量和RNA剪接分析，是一种基于杂交原理分析mRNA的方法，既可对mRNA进行定量分析又可研究其结构特征，灵敏度和特异性都很高。

3.原位杂交：①可对mRNA进行区域定位②是利用杂交原理建立的组织原位mRNA检测技术，可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位。

同时也可作为定量分析的补充。

③通过设计与目标mRNA碱基序列互补的寡核苷酸序列，标记后作为探针；该探针能够特异性地与目标靶序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。

④虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。

（二）两种变换的聚合酶链式反应是常用的mRNA检测方法1．反转录PCR（RT-PCR）：可用于mRNA的半定量分析。

它是以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。

RT-PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析2．实时定量PCR(RQ-PCR):常用于mRNA的定量分析是定量分析mRNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。

12.通过蛋白质检测揭示基因翻译水平的表达特征实验方法与原理：（一）采用特异抗体经Western印迹可直接测定基因编码多肽：Western印迹（Western blot）是一种免疫印迹技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。

当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法就是利用Western印迹对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。

（二）酶联免疫吸附分析：是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质分析基本方法。

该方法不需经电泳分离待检样品蛋白质，而是预先将样品包被在支持体上，以后反应过程与Western印迹大致相同——顺序结合（即“吸附”）特异抗体（一抗）及与酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附”抗原），再进行酶-底物反应。

反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。

（三）免疫组化实验可对组织/细胞表达的蛋白质进行原位检测：免疫组织化学（immunohistochemistry）与免疫细胞化学（immunocytochemistry）原理相同，都是利用标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的方法，简称为免疫组化实验。

近年来由于荧光标记抗体的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法。

（四）流式细胞术用于分析表达特异蛋白质的阳性细胞：流式细胞术（flow cytometry）在细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。

13.高通量检测技术高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是在大量核酸、多肽信息累计（即资料库）基础上，采用微板作为分子载体，制作集成“芯片”，以自动化操作系统进行分子杂交的试验过程14.高通量检测技术成为基因表达研究的有力工具（一）基因芯片和高通量测序技术可在基因水平高通量地分析基因表达1.基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法基因芯片（gene chip）又称DNA微阵列(DNA microarray)、DNA芯片（DNA chip）, 是将大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、microRNA等) 集成在同一基片上，组成密集分子排列，通过与标记样品进行杂交，检测、获取细胞或组织的基因信息。

2. 高通量测序技术是新一代基因表达谱分析方法（二）蛋白质芯片和双向电泳可在蛋白质水平高通量地分析基因表达1．蛋白质芯片；是一种对蛋白质的表达和功能进行高通量分析的技术。

是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用以识别复杂生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质/DNA-蛋白质/RNA-蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子-蛋白质等的相互作用。

根据蛋白质芯片制作方法和用途不同，可将其分为1. 蛋白质检测芯片2. 蛋白质功能芯片两大类蛋白质检测芯片包括:1.抗体芯片2.抗原芯片3.配体芯片4.碳水化合物芯片等2．双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达谱的分析和鉴定原理: 根据蛋白质分子的两个属性——等电点和分子质量——将蛋白质混合物进行分离。

电泳结果经染色后，即可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶中将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用质谱（mass spectrum）技术进行定性分析，对差异表达的蛋白质进行鉴定。

15.利用生物信息学方法进行基因功能注释(一）通过序列比对预测基因功能（二）利用生物信息学方法分析基因芯片数据（三）通过生物信息学方法分析蛋白质结构来预测蛋白质功能16.利用生物网络全面系统地了解基因的功能（一）利用生物网络研究基因调控（二）利用生物网络研究信号转导（三）利用生物网络研究代谢途径（四）利用生物网络研究蛋白质相互作用17.基因的生物学功能鉴定技术一、采用功能获得策略鉴定基因的功能基因功能获得策略即通过将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因的功能。

常用的方法有转基因和基因敲入技术等。

（一）用转基因技术获得基因功能转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞中，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，再将受精卵或胚胎干细胞植入受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代（二）基因敲入可以实现基因的定向插入基因敲入( gene knock-in)是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因, 或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。

通过基因敲入，可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。