国境口岸伊蚊专项监测方案
为有效落实国家质检总局关于寨卡病毒病和黄热病传播媒介伊蚊及携带病原体专项监测的要求，规范国境口岸范围内及输入性伊蚊监测操作，特制定本方案。

一、监测目的
（一）掌握国境口岸伊蚊种类构成、密度、分布及季节消长和长期趋势。

（二）掌握国境口岸媒介伊蚊及输入性伊蚊携带寨卡病毒、黄热病度的情况。

（三）为寨卡病毒病和黄热病风险评估、预测预警、控制规划提供科学依据。

二、监测对象
国境口岸及输入性伊蚊，以及所携带病原体。

三、监测范围
国境口岸及周边400米环境范围，各检验检疫机构可根据本口岸实际适当扩大监测范围。

入境交通工具（包括船舶、航空器、列车等）、集装箱、货物、快件及邮包等。

四、监测时间
2016年4月-11月，每月中旬监测1次。

五、监测方法
（一）诱卵器法
1.器具：无盖黑色诱卵器、白色滤纸、标签纸等。

2.方法：每个监测点放置50个诱卵器，各诱卵器间隔不少于10米，连续放置7日，于第4、7日分别检查、收集诱到的成蚊及蚊卵，记录阳性容器数。

3.密度计算：
诱蚊诱卵器指数＝（阳性容器数/回收有效的容器数）×
100%
（二）BioDiVector（BDV）帐诱法
1.器具：选用BDV蚊帐（外层：长×宽×高：
2.2m×1.9m ×1.8m；内层：长×宽×高：1.0m×0.7m×1.8m）（该蚊帐可自制或定制，见图1）、计数器、电动吸蚊器等。

2.方法：在上午9时和下午4时各1小时伊蚊活动高峰时段内，将蚊帐悬挂，诱集者位于内部封闭蚊帐中，在诱蚊开始前，诱集者通过操作装置将外帐下摆降低至地面；诱蚊开始时通过该装置将外帐下摆升至离地面300mm高，在监测时间内任由蚊虫飞入外帐内；诱蚊结束后再通过操作装置将外帐下摆降低至地面，阻止进入帐内的蚊虫逃逸。

此时，诱集者可涂抹驱避剂或穿戴防蚊设备，出内帐，用普通电动吸蚊器捕获帐内蚊虫，捕获的蚊虫带回实验室分类计数，进行种类鉴定和病原体检测。

并记录诱蚊开始与结束的时间、地点、温度、湿度和风速。

3.密度计算：
蚊密度【只/（顶·小时）】=雌蚊数量/（蚊帐数·诱蚊时间）
六、风险评估
根据国家标准和国家疾病预防控制中心的风险评估数据，建议诱蚊诱卵器指数大于5，或/和帐诱蚊密度大于3为有传播风险;诱蚊诱卵器指数大于10，或/和帐诱蚊密度大于6有暴发风险;诱蚊诱卵器指数大于20，或/和帐诱蚊密度大于12有区域流行风险，需要持续清除孳生地和杀灭成蚊。

七、输入性伊蚊监测
采集通过入境交通工具、集装箱、货物、行李、邮包等带入境内的伊蚊，分类计数，并送实验室进行种类鉴定和病原体检测。

船舶输入性伊蚊重点监测的货物为原木、活动物和废旧物品，重点监测的部位为旧轮胎、缆绳堆、绞缆机底座、溢油池、对外开放的仓库、舱口及生活区外围、大型设备包装物和甲板的小型积水、驾驶台和底层的走廊及房间等。

八、种类鉴定
捕获到的成蚊均应进行种类鉴定，具备条件的实验室应对蚊幼虫进行种类鉴定或对其幼虫进行饲养，待其羽化为成虫后进行种类鉴定。

九、病原体检测
（一）生物安全
病毒RNA提取和扩增操作应符合生物安全要求。

（二）操作环境消毒
实验完毕后，所有可用高压消毒的物品均应在实验室内做高压消毒，不能用高压消毒的物品及实验台面和污染设备表面用有效的消毒剂消毒，实验室用紫外线灯消毒。

（三）病毒检测
1.实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR ）
本方案病毒检测采用RT-PCR法。

2.仪器设备
荧光定量PCR仪，生物安全柜，普通冰箱，-70℃超低温冰箱，普通台式离心机，高速冷冻离心机（转速可达20000g），微量可调移液器（10μl、100μl、1000μl）及配套带滤芯吸头，EP 管（1.5mL），涡旋器。

3.试剂
各检验检疫机构可根据本口岸实际选取合适的RNA保存液、病毒核酸提取试剂盒和RT-PCR试剂盒。

MEM和Hank’s液可采用商业化产品，也可自行配制（参见表1）。

标本处理液：在新鲜配制的95mL MEM中加入56℃热灭活30min的胎牛血清2mL、1mL庆大霉素（5000μg/mL）、1mL 两性霉素B（250μg/mL）和1mL青链霉素（青霉素G 10000U/mL、链霉素10000μg/mL），用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH7.2.
4.检测程序
（1）标本保存和运输
低温法：将采集的活体蚊虫直接放入-20℃冰箱冻死后取出，在冰盘上分类，编号，按30只一份，装入2mL螺口塑料管内，用耐低温油性记号笔记上编号，于-70℃以下保存待检。

已死亡蚊虫必须要在4小时以内完成上述操作。

样本使用液氮或干冰运送，干冰需完全覆盖送检样本。

RNA保存液法：将采集的活体蚊虫直接放入-20℃冰箱冻死后取出，在冰盘上分类，编号，按30只1份，装入盛有RNA 保存液的2mL螺口塑料管内，用耐低温油性记号笔记上编号，于-20℃或以下温度保存待检。

已死亡蚊虫必须要在4小时以内完成上述操作。

RNA保存液中的蚊虫样本可使用常规冰袋运送。

（2）标本处理
在冰上操作。

从-70℃容器或RNA保存液中取出蚊虫标本，倒入研磨器中，加入Hank’s液1mL吹洗，弃去液体后加入1mL 标本处理液，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸入1.5mL EP离心管，配平后置预冷4℃离心机上，20000g离心10min。

取上清液进行核酸提取，剩余的蚊标本研磨液需保存在-70℃冰箱以备复查。

（3）病毒核酸提取
直接采用病毒核酸提取试剂盒，按照说明书操作。

（4）实时荧光RT-PCR检测
实时荧光RT-PCR的检测操作和结果的判读按照相应商品试剂盒说明书进行。

图1.BioDiVector（BDV）诱蚊帐
A) 蚊帐尺寸，B) 外帐完全展开至地面，C) 帐内绳索装置，D) 通过绳索装置将外帐下摆升至离地面300mm，E) 诱集人员在内帐中诱集蚊虫，F) 已捕获活体蚊虫，装入塑料杯。