❖多克隆抗体：多株B细胞针对多个抗 原决定簇产生的抗体
❖单克隆抗体：针对某一抗原决定簇， 由单株淋巴细胞（克隆）所产生的 抗体
多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生
多克隆抗体的产生
❖ 以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定 簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断 中，有利划归 肿瘤的基本类型。
酶标亲和素
在AB复合物中，酶是标记 在生物素上，而后与亲和素 合成复合物。在标记的亲和 素-生物素方法中是将辣根 过氧化酶直接标记在亲和素 上，辣根过氧化酶与亲和素 间有极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏感
多聚物载体
1、 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
2、 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗 和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能 与二抗相联结的由HRP标记的多聚物
显示系统
辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 →HRP·H2O2 →有色分子终末产
物+ HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRP·H2O2：酶·底物复合物
显示系统
免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点 在于显色系统的差异： ❖ 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 ❖ PAP法： 利用PAP复合物 ❖ ABC法： 利用AB复合物 ❖ LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 ❖ EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体
标记抗体
1、在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体 的结合能用肉眼观察到
2、标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，碱性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒
3、标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性， 从而使染色敏感性降低
酶— 抗酶抗体复合物
通过免疫反应而不是化学方 法，将酶结合到抗体上，形 成具酶活性的免疫复合物。 如PAP复合物 （PeroxidaseAntiPeroxida seComplex），PAP复合物 属非标记性，保护了酶的活 性，比免疫荧光法敏感上千 倍。
多抗，可根据不同染色要求而选用 4、识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第一抗完成
显示系统
1、也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的，显示系 统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见，从而确定抗 原的存在及其定位
2、 显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在标记位点 形成有色分子的终末产物，若显色剂为DAB，则出现棕褐色 细颗粒沉淀 E(酶)+S(底物) → E·S(酶底物复合物) → P(反应产物) + E(酶) E(酶)可循环使用
二、免疫过氧化物酶染色技 术的基本原理
免疫过氧化酶染色技术的 基本原理
显色系统：三抗、酶、底物 联结系统：二抗 识别系统：一抗、组织抗原
识别系统
1、特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。特异性抗体具有 识别并结合靶抗原的功能，这是本技术的理论依据所在
2、特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求选用 3、特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有单抗又有
其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性
联结系统
1、联结或桥联抗体（一般为第二抗体） 2、按免疫学要求将识别系统与显色系统联结成为统一体 3、应采用何种联结抗体决定于特异性第一抗体是多克隆还是
免疫球蛋白的化学结构
❖Fc(Fragment crystalline)是免疫球 蛋白的羧基端，意为结晶片段，因 其纯化时呈结晶状态而名之，该片 段与抗原特异性有关
❖ Fab(Fragment antigenbingding)该 端是抗体与抗原特异性结合的部位， 每分子Ig能结合2个抗原分子
多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生
免疫组织化学技术 的原理及方法
目录
一. 基本知识 二. 基本原理 三. 方法 四. 结果的判断及异识
一、免疫组化技术的基本知识
❖ 免疫组化的基本概念
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原 抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理， 通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细 胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、 定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术 (immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术 (immunocytochemistry)。
一、免疫组化技术的基本知识
抗体 与抗原能特异性结合—生物学结合是免疫球蛋白Ig
抗原 两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白质具 有抗原性
免疫球蛋白的化学结构
❖ 免疫球蛋白根据重链结构命名IgG(γ),IgA(α)， IgD(δ),IgE(ε), IgM(μ)
❖ 五种免疫球蛋白只有两种类型的轻链，即： Kappa(κ)和Lambda(λ) 每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗 体分子决不可能既有κ链又有λ链。这一点在免 疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。
抗原的制备：
❖ 传统用蛋白提纯
❖ 近来可应用分子生物学技术：已知抗原 的基因结构，用其合成多肽，作为抗原， 如ER、PR抗原的制备
❖ 现有兔的单抗
多克隆抗体的选用
1、单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂， 价格更贵；在应用中不一定比多克隆抗 体好。
2、单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体 则敏感性高，如何选用完全决定于使用 的目的性。
❖ 常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目录 上常以 RaH（Rabbit against Human）表之。
❖ 多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一抗多克隆 抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用至关重要。
多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生
❖ 单克隆抗体的产生 应用细胞融合的杂交瘤（Hybridization），以针对 单一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细胞（肿瘤性 B细胞）融合形成杂交瘤，其特点是既能产生特异 性抗体，又能在体外无限地增殖。将瘤细胞在体外 培养或注入小鼠腹腔内而获单克隆抗体，由此产生 的小鼠抗人（抗原）的抗体常以MaH表示，现在亦 有兔的单克隆抗体。