黄酮标准曲线绘制的实验报告1.总黄酮的测定1.1 实验仪器电子天平AR2140;紫外可见分光光度计UV2754;型数控超声波清洗器KQ3200DB;超级恒温槽;Rotavapor R200 旋转蒸发仪 ;FD21C250 冷冻干燥机21.2 试剂及药品芦丁标准品硝酸铝国产分析纯（配成5 %）亚硝酸钠国产分析纯（配成10 %）氢氧化钠国产分析纯配成（配成1mol/L）95%乙醇，无水乙醇国产分析纯（配成60%乙醇 50%乙醇）DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）Vc（Ascrobic acid，维生素 C，抗坏血酸）没食子酸对照品：基准纯。

大青叶子采摘于海南大学东坡湖畔1.3实验步骤：及波长的确定样品60℃烘干粉碎机粉碎，过20目筛，装入试剂瓶中备用。

根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。

精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁标准样品37.5mg置于100mL烧杯中,用60%乙醇溶解后定容至25mL 容量瓶中,摇匀，即可得1.5mg/mL的芦丁标准溶液。

及绘制标准曲线精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL ,分别置于10mL 容量瓶中，并定容至刻度线。

得到0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的标准品溶液，分别取1ml到试管中各加5 %亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol /L氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min 后,分别在510nm 处测定其吸光度（Tai,Cai&Dai,2011）。

（以试剂空白做参比）以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。

用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2。

序号浓度（ug/ml）吸光度1 0 02 15 0.1803 30 0.3494 45 0.5465 60 0.7276 75 0.8847 90 1.063表1-1：芦丁标准曲线测定数据图1-2：芦丁标准曲线根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。

取黄酮提取液，取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。

取稀释好的溶液4份1ml置入10ml 的比色管中，其中一份用60%的乙醇定容，作为参比溶液。

其余各份各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol 氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度。

代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以芦丁为参比）,三次结果取平均值。

经换算后得样品中总黄酮含量。

样品总黄酮含量(mg/g)=X*n*V1/( V *W)式中：X—测出的浓度，mg/ mL;（直接代入，不用换算。

）n—稀释倍数，量纲为1;V—样液总体积，mL;IV—测定时取样体积，mL;W—样品质量，g。

2.总分含量的测定2.1 实验仪器ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;DELA犯O型pH计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司;723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司;DK一512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比色管管(10mL);烧杯、移液管、吸耳球。

2.2试剂及药品没食子酸对照品：基准纯，购于上海分析试剂厂，置50℃真空干燥箱真空中干燥4 h。

乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2.3 Folin—Ciocalteu比色法测定总酚酸含量3.3.1 Folin—Ciocalteu试剂的配制称取20 g钨酸钠和5 g钼酸钠于圆底烧瓶中，用140 ml蒸馏水溶解，加入10ml 85％的磷酸溶液和20 ml 浓盐酸，文火回流10 h ，然后加入3 g 硫酸锂及15 ml 双氧水，加热沸腾15 min 至亮黄色，不得带微蓝和绿色。

冷却，移入250 ml 容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中，4℃冰箱保存。

准确称取15．00 mg 干燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至50ml ，制成0.3mg/mL 没食子酸的溶液，作为对照品溶液。

将0.3mg/mL 的没食子酸标准溶液分别配制成0.0mg/mL ，0.03mg/mL ，0.06mg/mL ，0.09mg/mL ，0.12mg/mL ，0.15mg/mL 、0.18mg/mL 、0.21mg/mL 的溶液，分别取1mL 置于10mL 的容量瓶中，加入2 ml 福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。

振荡一下，静置2h (Guo&Wei,2011)。

同时制作空白管。

为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。

于765 nm 波长处测定吸光度值。

2.3.3标准曲线的制备以吸光度A 为纵坐标,浓度c 为横坐标,绘制标准曲线。

用最小二乘法进行线性拟合,得c 与A 的线性回归方程以及相关系数R 2。

表3-1：没食子酸标准曲线测定数据图3-1：没食子酸标准曲线 取提液2ml 至10ml 的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。

取稀释后溶液1ml 四份,分别置于10mL 比色管中，加入2 ml 福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。

振荡一下，静置2h 。

同时制作空白管。

为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。

于765 nm 波长处测定吸光度值。

总酚酸含量计算：序号浓度（ug/ml ） 吸光度（WL765.0）13 0.132 26 0.284 39 0.411 412 0.582 515 0.712 618 0.843 7 211.013多酚含量（mg/100g ）=100g 0.5X(mg)⨯⨯⨯）总酚酸称样量（稀释倍数3.清除 DPPH ·的能力的测定 3.1.实验仪器、药品及试剂 2.1.1 实验仪器ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司; DELA 犯O 型pH 计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司; 723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司; DK 一512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司; 容量瓶(250mL ，10OmL ，25mL)、比色管(10mL); 烧杯、移液管、吸耳球。

DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ，二苯代苦味肼基自由基）； Vc （Ascrobic acid ，维生素 C ，抗坏血酸）为分析纯； 无水乙醇，蒸馏水配制0.06mMDPPH 试剂，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用。

准确称取17.6mgVc 到100mL 的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL 的容量瓶中定容至刻度线及可以得到2mmol/L 的母液，分别量1、2、3、4、5、6ml 至10ml 的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.2mmol/L 、0.4mmol/L 、0.6mmol/L 、0.8mmol/L 、1mmol/L 、1.2mmol/L 的溶液。

从以上比色管中分别取0.1ml 溶液置于试管中再加入3.9ml 的DPPH ，反应30min,在517nm 测出吸光值(Thoo&Ho,2010)，用无水乙醇代替待测液作为对照，用无水乙醇作空白，重复三组。

清除率=[(Ac-Ai)/Ac]×100%式中，Ac ：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL DPPH 溶液的吸光度；Ai ：0.1 mL 待测液加 3.9mLDPPH 溶液的吸光度。

表3-1：VC 标准曲线测定数据 以吸光度A 为纵坐标,浓度c 为横坐标,绘制标准曲线。

用最小二乘法进行线性拟合,得c 与A 的线性回归方程以及相关系数R 2。

图3-1：VC 含量与吸光度的关系图3-1：VC 含量与清除率的关系取提液4ml 至10ml 的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释2.5倍。

取稀释后溶液0.1mL 三份,分别置于10mL 试管中，再分别加入配置好的DPPH 溶液3.9mL,摇匀，反应30min 后，分别在517nm 处测定其吸光度。

代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以Vc 为参比）,三次结果取平均值。

经换算后得样品自由基清除率。

4. 清除ABTS +自由基能力的测定4.1ABTS +自由基的配制准确称取0.19215gABTS 于50mL 的容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，浓度7mmol/L ；序号 C （mmol/L ）吸光度清除率/%0 00 1 0.2 0.529 14.92 2 0.4 0.424 30.90 3 0.6 0.32 46.73 4 0.8 0.209 63.62 5 1 0.11 78.69 61.20.02 92.397mmol/LABTS +.与2.45mmol/L 的高硫酸钾等体积混合，在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反应12~16h ，形成 ABTS + 自由基储备液。

该储备液在室温，避光的条件下稳定。

用前用无水乙醇稀释成工作液，于波长734nm 处测得其吸光度为0.7000（±0.02），再装入棕色试剂瓶中，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用。

4.2标准曲线的绘制(Zhu&Lian,2011)，用无水乙醇作空白，重复三组。

清除率=[(Ac-Ai)/Ac]×100%式中，Ac ：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL ABTS + 自由基溶液的吸光度；Ai ：0.1 mL 待测液加 3.9mL ABTS + 自由基溶液的吸光度。

表4-1：Vc 浓度与吸光值和清除率的数据 图4-1Vc 浓度与其吸光值的关系 图4-2：Vc 浓度与其清除ABTS能力的关系5.还原能力的测定5.1实验试剂磷酸盐缓冲溶液（配成PH6.6 0.2mol/l ）; K 3Fe(CN)6溶液（配成1%）; 三氯乙酸（配成10%）； FeCl 3（配成0.1%）； 没食子酸 无水乙醇序号 C （mmol/l ）吸光度清除率/% 1 00.00 20.10.57 12.04 3 0.2 0.493 23.92 4 0.3 0.422 34.88 5 0.4 0.351 45.83 6 0.5 0.276 57.41 7 0.6 0.2 69.14 8 0.7 0.118 81.79 90.80.035 94.605.2标准曲线的绘制磷酸盐缓冲溶液(pH6.6 0.2mol/L)：准确称取7.16g 的磷酸氢二钠至100mL 的烧杯中用蒸馏水溶解后，置于100mL 的容量瓶中用蒸馏水定容，即可得到0.2mol/L 的磷酸氢二钠，同样的方法配制0.2mol/L 的磷酸二氢钠。