一、小鼠巨噬细胞分离培养
小鼠脱颈处死，浸入75%酒精中5min后，于腹中线处剪开皮肤，暴露腹壁肌肉，用酒精消毒腹膜壁，用无菌注射器将PBS或无血清DMEM培养液5ml 注入腹腔，仰卧平放并轻柔小鼠腹部2~3min，静置5min后，使动物体倾向一侧，用注射器抽取腹腔液约4~4.5ml，1500rpm离心8min，去上清，用含10%小牛血清的DMEM培养液进行细胞计数，调整细胞浓度为lx10∧6个/ml(取出一滴细胞悬液经台盼蓝染色，细胞存活率大于99%)，5ml/瓶接种于25cm2的培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，2-3小时后更换培养液除去未贴壁细胞，贴壁细胞则为腹腔巨噬细胞。

注：巨噬细胞不增殖，不传代，能培养存活2-3周，细胞形态基本不变，细胞贴壁成不规则形状。

二、细胞计数
1.制备细胞悬浮液，用DMEM培养基进行计数
2.准备记数板：用蒸馏水冲洗，擦镜纸擦拭，再用酒精擦净，2-3次
3.加样
4.计数：用台盼蓝染色计数。

细胞悬液细胞数/ml=4个大方格总数/4×10∧4，如计算前已稀释再乘稀释倍数
三、药物配制
将挥发油配成64mg/ml母液，用DMSO助溶，用无血清DMEM培养液稀释，使其终浓度为3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml。

四、挥发油对细胞毒性检测
将浓度为1×10∧6个/ml的细胞悬液1ml/孔接种于16孔板中，置培养箱中培养，24h后加入不同浓度的挥发油，同时设DMSO对照、空白对照及空白调零孔。

培养24h后弃培养液，每孔加入ml无血清培养液和20ulMTT(5mg/ml)液，继续培养4h，然后弃培养液每孔加入 150ulDMSO，微量振荡器振荡10min后，采用酶标仪测定其在570nm波长的吸光度(A值)，并用下列公式计算细胞的存活率:
药物组A值均数
细胞存活率(%)= x100
空白组A值均数
五、细胞炎症模型建立
为建立体外细胞炎症模型，确定后续实验中LPS刺激巨噬细胞的时间和浓度，对LPs刺激巨噬细胞的时效与量效关系进行了研究。

采用ELISA或RT-PCR测定小鼠腹腔巨噬细胞上清液中TNF-a含量来研究时效与量效关系。

时效关系：培养24h后的细胞分组加药：空白组（完全培养液）、LPS 1h组（终浓度为1ug/ml）、LPS 3h组（1ug/ml）、LPS 6h组（1ug/ml）、LPS 12h组（1ug/ml），分别在规定时间终止培养，弃去培养液。

用ELISA法，450nm测TNF-a含量。

量效关系：方法同上，分6组LPS浓度分别为0、0.001、0.01、0.1、1、10ug/ml
六、细胞炎性因子检测
小鼠β-actin Forward 5’一GCTACAGCTTCACCACCACAG一3’Reverse 5’-GGTCTTTACGGATGTCAACGTC一3’288bp。