Eastern blotting
第二章 食品微生物鉴定技术和方法
第二节 食品微生物学的现代鉴定方法 2. 23S、16S、5S rRNA序列相似性
核糖体 70S 30S 50S
16S
21 34 蛋白质
23S+5S
第二章 食品微生物鉴定技术和方法
第二节 食品微生物学的现代鉴定方法 16S亚基保守性高，是细菌进化的计时器 • 普遍存在 •细胞RNA含量较高 •rRNA稳定 •16sRNA序列保守 •16sRNA分子量适中
2013-10-8 36
第二章 食品微生物鉴定技术和方法
第二节 食品微生物学的现代鉴定方法
具体测定方法：
•采用RNase T1酶可以将16S rRNA酶解 •在G位点上切割，得到6～20个碱基大小的序列 •对这些6～20碱基片段进行分离、测序
食品表面微生物的检测
1.棉拭/棉拭漂洗法 是表面微生物检验中最古老、应用最广泛的方法， 它不仅应用于食品及乳制品，而且还用于医院、 饭店。 方法：将1.5ml液体加到平整的表面上，在3cm2区 域内擦拭15s，然后用微升移液管取0.1ml和 0.5ml液体，将液体在平板计数琼脂或选择性培 养基上涂布或倒平板计数。
（2）最大可能值法。作为一种统计学的方法来 测定活性细胞。 （3）染色还原技术。估计拥有还原能力的活性 细胞数目。 （4）直接显微镜计数法。活性和非活性细胞。
检测食品中微生物总数的方法
常规的标准平板计数（SPC）
将一部分食品样品混合或者均质化，在适当 的稀释液中进行梯度稀释，然后涂布或者倾注到 适宜的琼脂培养基上，在适当的温度下培养一段 时间后，使用电子计数器对可见的菌落进行计数。 SPC法是目前测定活细胞数和食品产品中菌 落形成单位数最广泛的方法。
MPN法的优点： （1）这种方法相对比较简单 （2）与SPC法相比，不同实验室得到的结果更加可 靠，相似率较高。 （3）特殊微生物群体可以通过适当的选择性培养 基进行测定。 （4）这是一种测定粪大肠杆菌群含量的方法。 缺点：精确度低。
检测食品中微生物总数的方法
染色还原试验
在估测相关产品中活菌数量时，通常使用两 种染色剂：亚甲基蓝和刃天青。
微生物纯培养的获得的方法
传统发酵食品的starter的确定or 优势菌株的确定 例如：金华火腿的主要发酵菌； 优势细菌：乳酸菌、葡萄球菌 优势酵母菌：欧诺比假丝酵母、红酵母 微生物生态学方面的菌株确定？？ •非原位检测鉴定、原位检测鉴定
检测食品中微生物总数的方法
4种基本方法：
（1）标准平板计数或好氧平板计数，适用于活 细胞或菌落形成单位。
GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌
作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，
从分子水平上判断物种的亲缘关系。
G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定 但具有相似G+C含量的生物并不一定表明 它们之间具有近的亲缘关系。
同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在4～5%
以下；同属不同种的差别应低于10～15%； G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一 项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要
第二章 食品微生物鉴定技术和方法
第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法
第九版《伯杰氏细菌学手册》简介： 内容分四卷： 第1卷：一般医学和工业方面重要的革兰氏阴性细 菌。
第2卷：放线菌以外的革兰氏阳性细菌。
第3卷：古细菌、蓝细菌及其他革兰氏阴性细菌。 第4卷: 放线菌。
第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法 新的分类方法:数值分类、核酸在细菌分类 中的应用、遗传学方法、血清学和化学分类 等。 鉴定方法的革新。新版在表型特征基础上， 以DNA资料对属、种的分类地位给予决定性 的判断。将DNA中G+C mol％含量的测定、 DNA杂交、RNA寡核苷酸的顺序分析、细胞 化学分析ຫໍສະໝຸດ 数值分类等方法应用到细菌的分 类学上。
意义。 若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的 菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是 同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。
第二章 食品微生物鉴定技术和方法
第二节 食品微生物学的现代鉴定方法 1. DNA同源性 Southern blotting （DNA-DNA) Northern blotting (DNA-RNA) Western blotting (Pro-Anti)
16S rRNA基因约含有1540个核苷 酸，分可变区和保守区，不同微 生物可变区核苷酸序列不同，从 而可以利用这些特异性序列进行 微生物的鉴定；
细 菌 域 Domain bacteria
古（生）菌 域 Domain archaea
真 核 生 物 域 Domain eukary ota
紫色细菌
线粒体
•“病灶”分离法
•单细胞或单孢子分离法 •特殊菌类——环保降解菌的分离
微生物的分离、纯化与接种技术
接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
微生物的分离、纯化与接种技术
划线接种，分离纯化
灼烧
第二章 食品微生物鉴定技术和方法
第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法
甲烷球菌属
甲烷杆菌属
真菌
植物
叶绿体 蓝细菌
革兰氏阳性细菌 无硫绿细菌
甲烷八叠球菌属 热球菌属
极端嗜盐菌 伪变形虫
动物 纤毛虫
黄杆菌
栖热胞菌属
热网菌属
热变形细菌
粘菌
鞭毛虫
产液菌属
微孢子
毛滴虫
双滴虫（假滴虫属）
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生物总系统发育树 （根据16S rRNA 序列比较绘制，引自《布氏微生物学》 2000）
第二章 食品微生物鉴定技术和方法
第二节 食品微生物学的现代鉴定方法 1. DNA同源性和DNA中（G+C）摩尔分数 （G+C)%= （G+C)/(A+T+C+G)% Tm法（热变温度法）测定 菌株间相差2.5～4.0％；种间相差5～10％以 上；属间相差10％以上
每个生物种都有特定的GC%范围，因 此 可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC% 范围为25--75%，变化范围最大，因此更适 合于细菌的分类鉴定。
食品表面微生物的检测
3.琼脂注射/琼脂肠法 琼脂注射法：将1个100ml的注射器去掉针头，改造成中 空的柱体，并在中空的部分注入琼脂，通过推动活塞将琼 脂从柱体底部挤压到待测表面上，将露在外面的那层切下， 置于皮氏平皿中，经过培养后进行菌落计数。 琼脂肠法：与注射法类似，只不过用的是塑料试管而不是 改造的注射器。 广泛用于肉制品或食品加工设备表面微生物的检测。 缺点同RODAC法，适合菌落分散和表面污染程度较轻的 样品。
第二章 食品微生物鉴定技术和方法
第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法
伯杰氏手册沿革：
伯杰氏手册自从1923年出版第1版，直至1974年第8版，均使用 《伯杰氏鉴定细菌学手册》(Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology)。 1984年开始至1989年分四卷出版，并改名为《伯杰氏系统细菌 学手册 》(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)(第一 版) 1994年又将"系统手册"1-4卷中有关属以上分类单元的分类鉴定 资料进行少量的修改补充后汇集成一册仍用原来书名出版，故称 之为《伯杰氏鉴定细菌学手册》第九版
检测食品中微生物总数的方法
显微镜菌落计数法 是通过显微镜对载玻片琼脂层上生长的微小菌落 计数。首先进行涂布，将0.1ml的牛乳琼脂混合 物涂布到4cm2的载玻片上，经培养，干燥和染色， 借助显微镜对微小菌落进行计数。 另一种方法是将2ml融化的琼脂与2ml热牛乳混合， 随后取0.1ml已经接种的琼脂涂抹到4 4cm2的载 玻片上，最后用硫堇蓝染色，用16mm物镜的宽 视野显微镜观察载玻片。
微生物纯培养的获得的方法 无氮培养基——筛出固氮菌； 无有机碳源的培养基——筛出硝化细菌； 无有机碳源的培养基且无氧有光环境——筛出光 合细菌； 高浓度NaCl的培养基——筛出耐盐菌株
伊红—美蓝的培养基——筛出大肠杆菌；
青霉素的培养基——筛出酵母菌、霉菌； ……
第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法
检测食品中微生物总数的方法
常规的标准平板计数（SPC） 记录产品中全部活细胞时，要考虑以下因素： 1）采用的取样方法 2）食品样品中有机体的分类 3）食品生物区系的种类 4）食品原料的种类 5）食品产品的预检历史记录 6）所用培养基的营养程度 7）所用的培养温度和时间 8）pH值、aw和培养基的氧化还原电位 9）所用的稀释液类型 10）食品样品中有机体的相对数量 11）竞争或拮抗有机体的存在
食品表面微生物的检测
其他检测方法：
1）直接表面检测法 2）粘性薄膜法 3）棉拭/琼脂斜面 4）超声波装置 5）喷雾枪法
第二章 食品微生物鉴定技术和方法
第一节 食品微生物纯培养的获得和传统的鉴定方法
微生物传统的鉴定方法
细菌：伯杰氏鉴定细菌学手册（第八版1974、第 九版1994）、伯杰氏系统细菌学手册（第一版） 1984~1989，2000年分五卷出版。 放线菌：中国科学院微生物研究所编著的放线菌 目分科、分属检索表 真菌：Smith、 Alexopoulos (阿历克索鲍罗 斯 ） 、 Ainsworth（安斯沃思）的分类系统
进行染色还原实验时，食品上清液加入任何 一种染色剂标准溶液，亚甲蓝会从蓝色还原为白 色，而刃天青则从暗蓝色还原为粉红色或白色， 染色剂还原的时间与样品中微生物的数量成正比。