优点：装置简单、价廉、死体积小。 缺点：是允许进样量小，重复性差，只 能用于低压系统(<10MPa,压力高了，密封垫 会泄漏)。
高效液相色法
2．停留进样 停止流动相流动后再进样，以防止泄漏，
可用于高压。 缺点：重新升压后会产生不稳，保留时
间和峰形重复性比较差。
高效液相色法
3．阀进样 结构和作用原理与气相色谱中所用的
高效液相色法
操作条件
GC：加温操作。 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。
高效液相色法
第一节 高效液相色谱仪
高效液相色法
高效液相色法
高效液相色法
高效液相色法
组成部件
主要部件：高压输液系统、进样系统、分 离系统和检测系统。 辅助装置：脱气机、梯度洗脱装置、自动 进样装置、数据处理系统。
六、高效液相色谱法
高效液相色谱法：以高压输出的液体 为流动相的色谱技术。 High Performance Liquid Chromatograph
HPLC
高效液相色法
高效液相色谱法的特点
1. 高压：对流动相施加高压，使其迅速地通过色 谱柱液； 2. 高效：分离效率大高，甚至可实现手性分离； 3. 高灵敏度：采用高灵敏度的检测器; 4. 速度快：与经典液相色谱法相比，高效液相色 谱法所需的分析时间较少，一般少于 1h ； 5. 应用范围更广。
第二节 液相色谱中的固定相和流动相
一、液相色谱固定相 二、液相色谱流动相
高效液相色法
一、液相色谱固定相
1．按固相材料的刚性程度分类
刚性固体
硅胶：用于液固色谱的固定 相，液相色谱的担体，化学 键合固定相基质材料。
硬质凝胶
聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而 成的多孔颗粒：只应用在离子 交换色谱和凝胶色谱中。
六通阀相同。 优点：进样准确，重复性好，适用于定
量分析，更换不同体积的定量管，可调整 进样量。
高效液相色法
高效液相色法
4．自动进样
由计算机自动控制定量阀，按预先编 制好的程序进行进样。
优点：可自动完成几十或上百个样品的 分析。在进行大量样品的分析时，使用自 动进样器操作可节省大量人力和时间。
缺点：装置成本高。
高效液相色法
HPLC与GC的比较
相同点：具分离和分析功能，均可以在线检测。
不同点：
分析对象
GC： 适于能气化、热稳定性好、沸点较低的样品， 不适于高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品。占有机物的20%。
HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制， 适于 溶解后能制成溶液的样品；分子量大、 难气化、热 稳定性差及高分子和离子型样品。 占有机物的80% 以上。
固定波长紫外检测器
固定波长： 254 nm或280nm
高效液相色法
2．荧光检测器 工作原理：利用某些试样具有荧光特性 进行检测。 特点：高灵敏度、高选择性；
对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应；
高效液相色法
高效液相色法
3．示差折光检测器
工作原理：折光指数与组成有关，连续检 测参比池和样品池中流动相之间的折光指 数差值。差值与浓度呈正比；
高效液相色法
V) 示差折光 (RI) 荧光(FD) 红外吸收 (IR) 极谱 电导 质谱
类型 选择性
最高灵敏度 （g/mL）
510-10
温度 影响
低
流速影 用于梯度
响
洗脱
无
可以
通用性
510-7
有
无
不可
选择性 10-12~10-9
低
无
选择性
~10-7
低
无
可以 可以
选择性 10-10~10-9
高效液相色法
低压梯度 ： 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或
多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压 泵中混合。如双元梯度、四元梯度等。
高效液相色法
二、进样系统
进样方式： 隔膜注射器进样 停留进样 阀进样 自动进样器进样
高效液相色法
1．隔膜注射器进样
色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时 用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。
要求：具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可 调、耐腐蚀等。
高效液相色法
高效液相色法
2．梯度洗脱 作用：分离过程中改变流动相的组成 ，使所 有峰都获得最佳分离效果，分析时间缩短。 基本方式：高压梯度、低压梯度。
高效液相色法
高压梯度： 利用两台高压输液泵，将两种不同极性
的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合 后进入色谱柱。
高效液相色法
流动相
GC：流动相为惰性气体，如H2、N2、He、Ar； 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。
HPLC： 流动相为液体； 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选
择性、改善分离度，增加了额外因素，如流动相极 性、pH值、不同比例的两种或两种以上液体的配比。
流动相种类较多，选择余地广。
特点：通用型检测器； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于
梯度洗脱。
分类：偏转式、反射式和干涉型三种。
高效液相色法
偏转式：它是基于折射率随介质中的成分变化 而变化，如入射角不变，则光束的偏转角是流 动相(介质)中成分变化的函数。因此，测量折 射角偏转值的大小，便可得到试样的浓度。
高效液相色法
高效液相色法
有
有
选择性
10-9
有
有
通用性
~10-8
无
无
高效液相色法
困难 不可 可以
1．紫外检测器 特点：
应用最广： 适于约有70％的样品。 灵敏度高： 线性范围大： 死体积小：（1mm × 10mm ，8 μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感。
分类：固定波长型、可调波长型和二极管阵 列检测器。
高效液相色法
高效液相色法
高效液相色法
三、色谱柱 组成：
包括柱管和固定相两部分。柱管材料通常 采用优质不锈钢，柱长一般为5~40cm，内径 为1~6mm 。
高效液相色法
色谱柱的两端有烧结不锈钢或多孔聚四 氟乙烯过滤片，以防止柱内的填料流出。
填充好固定相后的柱子有方向性，在使 用时，应使流动相的方向与柱子管外箭头标 的方向一致。
高效液相色法
基本流程
高效液相色法
高效液相色法
一、高压输液系统 包括：由贮液瓶、高压泵、脱气机、梯度 洗脱等装置。
高效液相色法
1．溶剂脱气装置 作用：防止溶解在溶剂（流动相、试样）中 的N2、O2进入检测器而使噪声剧增。 脱气方式：氦气鼓泡、超声波脱气、真空脱 气等。
高效液相色法
2．高压泵 作用：输送流动相。无脉动或脉动极小，保 证输出的流动相具有恒定的流速 。