一、显微成像技术（一）普通光学显微镜⏹1.构成：⏹①照明系统⏹②光学放大系统⏹③机械装置⏹2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。

⏹3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。

⏹光学显微镜的分辨力R=0.61λ/N．A．⏹其中λ为入射光线波长；⏹N．A．为镜口率＝ｎs i nα/2；⏹n=介质折射率；⏹α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。

2、常用的光学显微镜⏹（1）普通双筒显微镜有较强的立体感。

⏹（2）荧光显微镜：研究细胞内物质的吸收、运输、及化学物质的分布及定位以紫外为光源。

⏹（3）相差显微镜，观察无色、透明、活细胞中的结构（未经染色的活细胞）产生明暗差异⏹（4）暗视野显微镜：观察未经染色的活体或胶体粒子适合观察细胞核、线粒体、细菌、霉菌等。

⏹（5）倒置显微镜培养细胞观察03年选择题倒置显微镜i n v e r s e m i c r o s c o p e⏹物镜与照明系统颠倒；⏹用于观察培养的活细胞，通常具有相差或D I C物镜，有的还具有荧光装置。

⏹学习重点：⏹1.光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜。

掌握电子显微镜的原理和样品制备方法，以及和光学显微镜的差别．⏹２.掌握酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技术的原理⏹３.了解细胞培养和细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养⏹4.离心分离技术⏹这一章每年都有真题出现，大部分以填空，选择和判断的题型出现，总体看来，题目难度在下降，但是实际应用的能力越来越看重，07、08年就近30分的考题第二章：细胞生物学研究方法1. 原理⏹以电子束作光源，电磁场作透镜。

电子束波长与 加速电压(通常50~120K V )的平方根成反比；⏹由电子照明系统透镜成像系统、真空 录系统、电源系统等5部分构成；⏹ 分辨力0.2n m ，放大倍数可达百万倍；⏹用于观察超微结构（小于0.2µm ）。

TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE ，TEM2. 制样技术⏹1）超薄切片 ⏹ 超薄切片厚度仅50n m 左右，用超薄切片机（u l t r a m i c r o t o m e ）制作。

⏹ 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。

4、 电子显微镜⏹ 由三大部分组成∶电子光学系统(镜筒)、真空系统、电子学系统(供电系统)。

观察的是亚显微结构⏹ 电子显微镜的样品也需固定、包埋、切片 （超薄切片，切片放在载网上）、染色等。

采用负染色：只染背景不染样品⏹ 透射电子显微镜，扫描电子显微镜3、 光学显微镜的样品制备与观察⏹ 3.1 样品的固定(f i x a t i o n )：醛类⏹ 3.2 包埋和切片(e m b e d d i n g a n d s e c t i o n i n g ) 切片厚度：1-10u m⏹ 3.3 染色(s t a i n i n g ):有机染料⏹ 3.4 放射自显影技术⏹ 断面的三种处理方法： ⏹ 蚀刻（ e t c h in g 蚀刻（no e t c h i n g蚀刻（d e e p e t c h i n g ）tip cell with etching.培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示Clathrin 衣被（二）扫描电子显微镜 ⏹ 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构；⏹分辨力为6~10n m ，因人眼的分辨力（区别荧光屏上 距离最近两个光点的能力）为0.2m m ，扫描电镜的 有效放大倍率为0.2m m /10n m =20000X 。

Scanning electron microscope （ SEM ）3）冰冻蚀刻 f r e e z e -e t c h i n g⏹亦称冰冻断裂。

标本置于干冰或液氮中冰冻。

然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。

向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。

然后将 组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（r e p l i c a ）。

2）负染技术⏹电镜观察需要有足够的反差。

用重金属盐(如磷钨酸) 染 色；吸去染料干燥后， 样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5n m 左右。

aineArchaebact⏹光学和电子显微镜成像原理⏹照明系统的波长是显微镜成像的一个重要因素，因为波长决定能被检测样品的最小极限电子显微镜与光学显微镜的基本区别二、细胞化学技术⏹1、酶细胞化学技术┌────酶的细胞化学反应─────┐│酶+条件初级捕捉剂│底物──→反应产物──→最终反应产物（酶反应）（捕捉反应）⏹2、免疫细胞化学技术（免疫荧光技术和免疫电镜技术）⏹3、细胞分选技术⏹流式细胞计，掌握原理⏹细胞的分选⏹染色体的分选F l o w C y t o m e t r y’s b a s i c s t r u c t u r e单细胞悬液真题再现2000年用流式细胞仪分选细胞和染色体，从生物学角度来看，应该注意的三个关键技术环节 (比较难)三、细胞工程技术⏹1、细胞培养***7年大题研究方法：体外培养动物细胞⏹08大题两道A为研究工作的需要，请你提出建设一间动物细胞培养室的设计规划，包括培养室的大小、格局、基本设备、经费预算等（10分）⏹B为了将培养中的单层表皮细胞制备成单细胞悬浮液，通常要添加E D T A或E G T A，以胰蛋白酶，请问添加这些试剂作用是什么？（5分）⏹1.1原代培养(prim⏹传代培养（二者区别？？）⏹1.2细胞系和细胞株(c e l l l i n e a n d c e l l s t r a i n)⏹1.3动物细胞培养方法⏹贴壁培养⏹悬浮培养⏹1.4植物组织培养(p l a n t t i s s u e c u l t u r e)（可以留意）⏹1.5植物原生质体培养（三）激光共聚焦扫描显微境L a s e r c o n f o c a l s c a n n i n g m i c r o s c o p e,L C S M⏹用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描；⏹能显示细胞样品的立体结构；⏹分辨力是普通光学显微镜的3倍；⏹用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。

⏹工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。

⏹为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。

2.3显微操作术⏹细胞核移植、基因注入、染色体微切和胚胎切割等手术四、分离技术⏹1、离心分离技术⏹速度离心和等密度离心⏹1.1速度离心分离细胞器和大分子⏹●差速离心⏹●移动区带离心⏹1.2等密度离心⏹蔗糖、甘油和氯化铯都是密度离心分离中的介质一、离心技术⏹是分离细胞器及各种大分子基本手段。

⏹转速10~25k r/m i n的离心机称为高速离心机。

⏹转速>25k r/m i n，离心力>89K g者称为超速离心机。

⏹超速离心机的最高转速可达100000r/m i n，离心力超过500k g。

（一）差速离心D i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n⏹特点：⏹介质密度均一；⏹速度由低向高，逐级离心。

⏹用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。

⏹沉降顺序：核⏹可可可将将将细细细胞胞胞器器器初初初步步步分分分离离离，，，常常常需需需进进进一一一步步步通通通过过过密密密度度度梯梯梯离离离心心心再再再行行行分分分离离离纯纯纯化化化。

2.2单克隆抗体技术(m o n o c l o n a la n t ib o d y t ec h n i q u e)筛选用的H A T培养基是选择性培养基在H A T培养基中，只有肿瘤细胞和正常细胞融合形成的杂交瘤细胞才能生存，而未融合的肿瘤细胞、正常细胞及非肿瘤细胞和正常细胞融合形成的细胞都会死亡单个细胞融合方法：有限稀释法2、细胞融合与单克隆抗体技术⏹2.1细胞融合(c e l l f u s i o n)⏹灭活的仙台病毒：促进融合的原因⏹聚乙二醇(p o l y e t h y l e n e g l y c o l，P E G)：促进融合的原因（三）密度梯度离心⏹用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。

⏹类型：速度沉降、等密度沉降。

⏹常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。

⏹分离活细胞的介质要求：⏹1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；⏹2）P H中性或易调为中性；⏹3）浓度大时渗透压不大；⏹4）对细胞无毒。

1.速度沉降v e l o c i t y s e d i m e n t a t i o n⏹用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器⏹特特特点点点：：：介介介质质质密密密度度度较较较低低低，，，介介介质质质的的的最最最大大大密密密度度度应应应小小小于于于被被被分分分离离离生生生物物物颗颗颗粒粒粒的的的最最最小小小密密密度度度。

⏹原原原理理理：：：介介介质质质密密密度度度梯梯梯度度度平平平缓缓缓，，，分分分离离离物物物按按按各各各自自自的的的沉沉沉降降降系系系数数数以以以不不不同同同的的的速速速度度度沉沉沉降降降而而而达达达到到到分分分离离离。

2.等密度沉降i s o p y c n i c s e d i m e n t a t i o n⏹用途：分离密度不等的颗粒。

⏹特点：⏹介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。

⏹力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。

⏹原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。

介质⏹蔗糖，甘油（1.3g/c m3）⏹氯化铯(大于1.3g/c m3)----- 浮力密度离心二移动区带离心⏹常用的是蔗糖密度梯度离心Differential centrifugationHighspeedLow speed五、分子生物学方法⏹1、基因工程技术：分，切，连，转，选（基因克隆）⏹2、P C R技术p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n⏹P C R即：p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n。