溶血全套实验操作规程
一, 抗碱血红蛋白（HbF）测定
1.取抗凝血1-2ml, 用等渗盐水离心沉淀, 洗涤红细胞3-4次, 将洗涤后的红细胞按沉淀体
积加1.5倍蒸馏水和半量四氯碳, 用力震荡混合5-6分钟, 使红细胞完全溶解后离心20分钟, 上层即为100g/lHb液.
2.对照管: 100g/lHb液0.02ml, 再加5ml蒸馏水, 混匀.
3.测定管: 100g/lHb液0.1ml, 加入预温至25℃的0.083M的KOH1.6ml，同时开动秒表，
混匀数秒钟，至1min整，立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液3.4ml，倒转混匀，过滤取上清夜。
4.分光光度计540nm，蒸馏水调零，分别测两管光密度。
HbF%=测定管光密度/（对照管光密度X5）X100
5.正常人1.0-3.1%，新生儿55-85%，一岁后接近正常人。
二，异丙醇试验
1ml7%异丙醇溶液，置有塞试管中，37℃水溶液预热数分钟后，加入0.1mlHb(10%)溶液，加塞混匀，计时观察，同时做正常对照。
若放在37℃水溶液中，5min出现浑浊，40min 之内出现沉淀，则为阳性。
三，血浆游离血红蛋白测定
试剂（ml）标准管测定管空白管
1. 10g/L联苯胺0.5 0.5 0.5
2. 被检血浆（血清）——0.02 ——
3. 标准血红蛋白0.02 ————
4．1%HO 0.5 0.5 0.5
5．10%醋酸液 5 5 5
（注：1-4试剂混合后，于室温下静置20min, 再加5试剂）
10min后，用比色剂（0.5cm）测定各管的光密度，波长530nm空白管为比色对照。
结果按下列计算：
血浆游离Hb(mg/L)=测定管光密度/标准管光密度（0.025）X100）
正常值：〈40mg/L
四，高铁血红蛋白还原实验
1，静脉采血1.5-2mL，加入含有38g/L枸橼酸钠抗凝剂的小瓶内，再加葡萄糖20mg.血液与抗凝剂按9：1混合，亦可用ACD抗凝。
2，将此血标本离心沉淀5分钟（1000R/M），或置于4℃冰箱24小时，待红细胞下沉后，吸取部分血浆，使血液与血浆之比约为1：1（相当于红细胞压积30-40%）
3，摇匀后，取此血液1.0毫升，加12.5%g/l亚硝酸钠-葡萄糖溶液和0.0004mol/L美兰液各
0.05ml,颠倒混合15次，使与空气中的氧气充分接触，加塞，37℃水浴（孵箱）保温3
小时（血不足用半量）。
4，取出后摇匀，吸取此血液0.1 ml,加于10ml0.02mmol/L磷酸盐缓冲液中，2分钟后，634nm 处（或红色滤光板）比色，用蒸馏水做空白，测定其光密度为A。
5，量取未加上述试剂，但同样孵育的血液0.1ml,按上述进行比色，测光密度为B，再于此液中加亚硝酸钠-葡萄糖溶液1滴，摇匀，5分钟后测定光密度为S。
结果：高铁血红蛋白还原率%=（1—A-B/S-B）X100%
正常值：〉75%
74-31%为杂合子，〈30%为纯合子
五，微量血红蛋白电泳
1，浸膜：将薄膜毛面朝下先漂浮于PH8.5TEB缓冲液中，待全部浸润后，用小镊子将其按入缓冲液中，至少15-20分钟。
2，点样：取出已浸透的薄膜，以滤纸吸取多余的水分。
取被检者及正常人（比较用）5%的Hb液，点样要求匀，直，细。
3，电泳: 槽内PH8.5硼酸缓冲液,用两层纱布搭桥。
毛面朝下置于桥上，点样端在负极约1cm 左右，150V，40-60分钟。
4，染色：将电泳槽内取出薄膜浸入染色液内，并不时翻动，约10分钟，取出放入漂洗液内直至薄膜底色度变白为止，取出晾干。
5，透明：将已干燥标本置透明液中浸泡15-20分钟，然后贴于玻板上阴干。
（气温过高易失败）
六，HbA2定量
将漂洗的膜取出，剪下HbA2和HbA（包括HbF）带，分别浸于2毫升和10毫升浸出液中约20分钟，其间振摇数次，使色带完全洗脱。
（注意：在气温过高时，洗脱时间不可太长，否则洗脱液兰色减退，并逐步变为紫色）。
用分光光度计，于620nm波长，用浸出液调零，测两者的光密度。
HbA2%=HbA2光密度/（HbA2光密度+5XhbA光密度）X100
正常值：（1.05-3.12）%
七，PH6.5电泳
将醋纤膜浸于PH6.5缓冲液中至少20分钟，取出醋纤膜，用滤纸吸取多余液体，点样于中线，同时用正常Hb液对照。
用100V，电泳45分钟，用丽春红S染色。
结果：HbH移向阳极，HbBart’s在点样线上，其余各种Hb均移向阴极。
八，溶血试验（简易法）酸
洗涤两次的红细胞配成50%浓度
管别AB型血清50%RBC 0.2M（HCL）37℃水浴
—————
患者对照
测定管(ml) 0.5 0.025 ——0.05 1小时对照管（ml）0.5 ——0.025 ————
溶血为阳性
实验室试剂配制
1，0.083MKOH：0.1MKOH稀释12倍（PH必须大于12）
2，酸性半饱和硫酸铵：取硫酸铵（（NH3）2SO4）400g加蒸馏水500ml,置于37℃水浴24小时不断搅拌，使达饱和，再冷至25℃，搅拌一次，使过量的（NH4）2SO4析出，上清液为饱和液，取上清液400ml加1MHCL20ml。
蒸馏水加至800ml，混匀室温保存（PH 必须大于3）
3，17%异丙醇溶液：17ML异丙醇加0.1mol/Ltris缓冲液（7.4）至100ml.PH大于7.2方可。
4，10g/L（1%）联苯胺：10g联苯胺溶于90ml冰醋酸内，然后加蒸馏水至100ml，贮存棕
色瓶，置于冰箱内使用数周。
5，1%H2O2：30%H2O2新鲜配制（稀释30倍）
6，100g/l(10%)醋酸溶液：取10ml冰醋酸，加蒸馏水至100ml。
7，标准Hb溶液：取以生理盐水洗涤过三次的压积红细胞与等体积蒸馏水，0.5倍体积的四氯化碳混合，剧烈震荡5min后，离心20min(2500r/min),吸取上层Hb液，用氰化高铁Hb法准确测定其浓度，稀释成100g/l（10%）Hb浓度，于低温冰箱保存，用时取0.01ml，加生理盐水至10g/l。
即为100mg/l（10mg%）应用标准液。
8，12.5g/l亚硝酸钠-葡萄糖溶液：亚硝酸钠：1.25
葡萄糖：5
加蒸馏水至100ml，用棕色瓶，4℃保存一个月。
9，0.0004mol/l美蓝溶液：美蓝（次甲基蓝，亚甲基蓝）15mg，家蒸馏水100ml，室温1-2个月。
10，0.02mol/l磷酸盐缓冲液（PH7.4）：
NA2HPO4·12H2O 229.5mg (1.1475g)
KH2PO4：52.2mg (0.261mg)
加蒸馏水100ml (500ml)
11，PH8.5TEB缓冲液：Tris: 10.2g (5.1g)
EDTA: 0.6g (0.3g)
硼酸：3.2g (2.6g)
加蒸馏水1000ml9500ml)
12，PH8.5硼酸缓冲液：硼酸：5.56g
硼砂(四硼酸钠)：6.87g
加蒸馏水至1000ml
13，0.09%丽春红：丽春红S或G：1.8g
三氯醋酸：26.8g
磺柳酸：26.8g
加蒸馏水至100ml，用前将上清夜以蒸馏水稀释20倍使用。
14，氨基黑：氨基黑10B：0.5g
甲醇：50ml
冰醋酸：10ml
蒸馏水：40ml
溶解而盛棕色瓶内。
15，漂洗液：甲醇（乙醇）：45ml
冰醋酸：5ml
蒸馏水：50ml
溶解而成
16，透明液：无水乙醇：70ml
冰醋酸：30ml
混合而成
17，PH6.5磷酸盐缓冲液：KH2PO4: 3.11g
NaHPO4: 1.49g(Na2HPO4·2H2O1.87g)
蒸馏水900ml
校正PH后稀释至1000ml
18，0.4mol/lNaOH：1M→稀释
19，0.1mol/lTris缓冲液（PH7.4）：Tris:1.21g
0.1NHCL40ml
加蒸馏水至100ml
20，1.0mol/l盐酸标准液：浓盐酸MW=36.465，比重1.18，含HCL36%-38%。
浓盐酸浓度约为11.7
浓盐酸（AR）43ml加水至500ml。