HTRF生物过程和抗体药物研发解决方案前言随着现代生物技术的迅猛发展，运用功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学等现代生化与分子生物学技术，结合基因工程、蛋白质工程、细胞工程等技术，使得生物技术药物研发高潮迭起。

当前，治疗性抗体药物研发已成为生物技术药物领域的热点。

治疗性抗体也称为抗体药物，指能在体内发挥疾病治疗作用的抗体制剂。

200年前，人们将自白喉杆菌培养上清液中分离到的可溶性毒素注入马体内，发现得到的抗血清可以治疗白喉，这是第一个用抗体治疗疾病的例子。

20世纪70年代德国学者Geroge KÖhler和英国学者Cesar Milstein利用细胞融合技术成功地制备了杂交瘤单克隆抗体 (mAb)以来，抗体的生产技术才实现革命性的突破, 其在诊断、治疗、预防和蛋白提纯方面显示了重要的作用和非常广阔的应用前景。

进入80年代，随着免疫学和分子生物学技术的发展，以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术开始被用于抗体的改造，人们可以根据需要对以往的鼠抗体进行相应的改造，以消除抗体应用的不利性状或增加新的生物学功能，还可用新的技术重新制备出各种形式的重组抗体，标志着基因工程抗体时代的来临。

自第一个基因工程抗体——人-鼠嵌合抗体于1984年诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，包括嵌合抗体，人源化抗体、小分子抗体（Fab片段、单链抗体、单域抗体等）、多价小分子抗体（双链抗体等）及抗体融合蛋白（免疫毒素、同位素等）等不断完善，目前全人抗体生产技术也已处于蓬勃发展中。

最近的统计显示，在基于生物技术背景而进行临床实验的药物研究中，单克隆抗体药物占据了18%，治疗性单克隆抗体已发展成为非常具有市场应用价值的产品。

2009年FDA批准的14个药物中有4个为全人抗体，而这4个抗体药物中有两个抗体来自强生公司，使强生公司称为2009年抗体药物的最大赢家。

目前，美国已批准26个单抗药物用于治疗，主要包括癌症，慢性炎症，移植，感染疾病和心血管疾病。

同时，伴随着基因组药物科学的发展，各类疾病的靶分子被越来越多的揭示，迫切地需要针对对各类疾病相关的靶分子的抗体药物。

抗体药物的筛选过程和作用机理在治疗性抗体的研发和筛选过程中，通常需要经过以下步骤：首先基于生物化学结合反应，利用HTRF或ELISA技术从几千至上万的样本库中筛选目标候选样本。

在确定候选样本可以与表面受体结合后，进一步从细胞水平确定候选样本与细胞的结合能力。

随后，确定候选样本的Kd，Kon/off 和IC50值，对抗体药物的亲和力等特性进行确定，最后一步是进行抗体药物的功能试验，如抗体药物激活细胞表面受体后，cAMP和IP-One的表达水平等等。

抗体药物进入人体内，通常主要通过五大作用机理发挥其功能效应：1)治疗性抗体可以和激活受体的配体结合，配体不再与受体结合，信号通路中断；2)治疗性抗体可以直接与目标受体结合，从而阻断配体受体的相互作用，并下调细胞表面目标受体的表达；3)通过抗体的分子的Fc段发挥功能效应，包括抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞溶解作用(CDC)；4)治疗性抗体1与细胞表面受体结合后，激活下游信号分子，包括影响细胞增殖、分化、细胞因子分泌的信号分子进一步调节细胞的功能；5）治疗性抗体与药物分子偶联，通过内吞作用进入细胞后，在溶酶体的作用下，释放药物分子发挥功能。

图1：治疗性抗体的作用机理(1-4来源于Andrew C. Chan,Paul J. Carter. Therapeutic antibodies forautoimmunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 10, 301-316. 5来源于David Schrama, RalphA. Reisfeld,Jürgen C. Becker. Antibody targeted drugs as cancer therapeutics. Nature Reviews DrugDiscovery 5, 147-159.) 为了考虑清晰度，图有改动，具体请见附件23HTRF 解决方案Cisbio 提供了一系列经过优化的试剂盒，检测工具和服务为生物治疗和生物工艺领域的研究和生产提供便利。

我们独一无二的产品可以定量检测样本中总免疫球蛋白含量和抗原特异的免疫球蛋白含量，这些有助于客户在细胞实验平台中从抗体库中筛选出针对细胞表面特异抗原的抗体。

Cisbio 在该领域主要包括二大产品线，第一大类的是HTRF®工具盒试剂，这些工具盒试剂可以帮助客户构建基于生物化学检测平台的抗体结合试验；另一大类的Tag-lite 产品线，这一产品线可以帮助客户构建基于细胞平台的抗体结合试验，测定抗体的Kd ，Kon/off 和IC50值，同时结合一些其他产品进行受体的内化试验和功能试验等，如GPCR 第二信使检测试剂盒（cAMP 和IP-One 等），受体的内化试验和激酶试验等等，用于对抗体的功能进行确定。

这两大产品线都依靠强大的HTRF 技术创造出均相的、稳定可靠的实验。

具体而言，主要的产品应用范围包括 一、抗体生产过程中克隆株的筛选通过HTRF®抗体检测试剂盒和其他一些试剂可以对细胞上清中整个IgG 蛋白进行定量检测，可广泛应用于高表达量抗体的细胞克隆株的筛选。

例如，通过HTRF®人样本总IgG 检测试剂盒，轻链Kappa 链和轻链Lamda 检测试剂盒，可以取代传统的ELISA 技术测定IgG 表达量。

ELISA 需要清洗，费事费力，而HTRF 技术为均相技术，不需要清洗，只需混合和孵育两步，更适宜于高通量检测。

二、、基于生物化学实验平台筛选和鉴定抗原特异的抗体HTRF®工具盒中的一些经染料标记的试剂如生物素、亲和素，抗标签蛋白（GST ，6HIS 等）试剂，抗不同种类的IgG 抗体等，可以被广泛运用在均相的，高通量的筛选试验中。

三、生物工艺生产中的质量控制（QC ）在抗体生产的生物工艺中，可以使用HTRF® IgG 检测试剂盒或者融合蛋白检测试剂盒（GST 和6HIS 等）对抗体、融合蛋白等进行质量控制，此试剂盒还可用于排除假阳性样本。

目前，Cisbio 的某些相关产品已被写入生物工艺中标准操作流程中（SOP ）中。

图2：竞争法筛选细胞表面RTK 激酶受体的特异性抗体原理图。

标记的天然配体被与RTK 受体结合的抗体取代，则检测信号减弱。

该筛选平台也可以采用非竞争法的模式，直接标记抗IgG 的二抗，则所有与受体结合的抗体都会产生信号，信号越强则代表结合能力越强。

四、基于细胞实验平台筛选和鉴定和细胞表面受体特异性结合的抗体Tag-lite平台可以用于表达和荧光标记细胞表面受体蛋白如GPCR，RTK等等。

通过与经HTRF®标记的抗IgG的抗体结合，可以直接从抗体库和杂交瘤上清中筛选针对Tag-lite细胞表面受体的抗体。

Tag-lite细胞可以和标记或者未标记的配体结合，通过竞争结合进一步鉴定抗体的结合能力。

五、客户定制服务HTRF®和Tag-lite技术为生物治疗和生物工艺领域提供客户定制服务支持，如果产品目录中暂时没有相关满足客户的产品，可以根据要求定制标记试剂，检测试剂盒等满足客户的需求。

4人单抗检测试剂盒(Human MAb Screening Assay)药物筛选和生物工艺领域经常需要对人IgG 或 Fc标签蛋白进行定量。

目前，含免疫球蛋白Fc 段的嵌合抗体或人源化单克隆抗体因为其潜在的治疗价值而受到越来越多的关注，人源化的单克隆抗体库也是重要的候选药物资源。

Cisbio基于HTR®F技术的人单抗筛选试剂盒是优化过的用于IgG检测、筛选和质量控制的试剂盒，适合高通量筛选，结果准确、稳定、可靠。

产品特点操作方法简单，快速灵敏度高，准确性好适用于自动化可以微型化与各种培养液和添加剂兼容应用领域在各种生物混合物中对IgG进行定量检测Fc标签蛋白的检测人源化抗体的筛选生物工艺中的质量控制实验原理HTRF人单抗检测试剂盒采用竞争法对人的IgG和Fc标签蛋白的进行检测，该试剂盒中含有一个Eu3+标记的多抗，特异性地针对人的Fc段，另一成份是标记了XL665的人IgG。

这种均相的实验方法无需洗涤，可以准确地定量所有人IgG亚型的含量，并且仅需要两个小时的孵育时间即可，非常快速。

图3 人单抗检测试剂盒实验原理5产品特性检测底限：5.5 ng/mL检测范围：5.5 to 4,000 ng/mL信号/背景值：11反应形式：96孔板或384孔板特异性：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4图4 据试剂盒中实验方法获得的人IgG标准曲线实验性能1.完整IgG和Fc段的检测不同特征的人Fc段嵌合抗体使用该试剂盒均可被检测到，但是不同嵌合抗体的亲和力不同，这与嵌合抗体的Fc段性质有关。

完整的IgG的亲和力高于部分Fc段抗体，但是完整IgG和部分Fc段抗体获得的浓度曲线是平行的，这意味着如果以完整IgG作标准品，根据曲线的偏移，可以计算出样本的浓度。

当然绝对的样本浓度需要用用样本相同的蛋白做标准品来计算获得。

图5 运用该试剂盒检测4种不同的嵌合抗体在不同浓度下的FRET信号62.培养液的兼容性使用磷酸缓冲液，培养液和RPMI等，对试剂盒的检测结果均无影响。

即使培液中加入10%的FCS胎牛血清，对实验结果也无影响。

该试剂盒不同于其他免疫试剂盒基于生物素-亲和素的办法来检测，需要排除胎牛血清的影响。

该试剂盒对培液不敏感，由于培液产生的淬灭作用可以通过计算ratio得到补偿。

图6 在磷酸缓冲液、细胞培液和 RPMI（含10&胎牛血清）的体系中检测IgG标准曲线3.实验的微型化该试剂盒与人Fc标签蛋白的克隆库筛选相适应，即使整个实验体系降低到12.5μl，对实验结果也无影响。

需要注意的是，实验体系中体积的减少需要与相应的小体积的微孔检测板相配套。

图7 运用Fc标签蛋白获得的IgG标准曲线实验体系按照50 µl，25µl和12.5 µl三个体系实验用的微孔反应板在括号中标明（标准的96孔板，96半孔板和标准的384孔板）。

订购信息7免疫球蛋白轻链(Kappa 链和Lambda链)检测试剂盒目前，人免疫球蛋白用于治疗的需求越来越大，伴随而来，在药物研发和生物工艺领域，对人免疫球蛋白进行定量测定的需求也越来越大！Cisbio基于其专利的HTRF技术开发出专门针对人免疫球蛋白轻链kappa链和轻链lambda链的检测试剂盒，为全人抗体的定量，筛选和质量控制提供非常好的解决方案。

产品特点操作方法简单，快速灵敏度高，准确性好适用于自动化可以微型化与各种培养液和添加剂兼容应用领域选择性筛选kappa链和lambda链适用于不同的IgG亚型(IgG1,IgG2,IgG3,IgG4)筛选100%全人抗体适于生物工艺中的质量控制实验原理HTRF 人轻链kappa链和人轻链lamda链的检测试剂盒采用夹心法特异性对对人IgG kappa链和lamda链进行测定。