以安琪酵母粉和大豆蛋白胨为组合碳源,维持总氮量不变,考察不同配比对菌体生 长与PGL合成的影响.确定氮源组成为:安琪酵母粉24 g L-1 、蛋白胨试剂11 g L-1.

2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素
2.4 碳源对工程菌生长与产酶情况的影响
Optimal carbon source :glycerol Optimal optical concentration :10 g L-1
摇瓶水平 4. 碱性果胶酶基因在 枯草芽孢杆菌中的表达 5. 重组碱性果胶酶 粗酶性质的初步研究
1. 碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
Bacillus sp. WSHB04-02 genomic DNA PCR Fnew-S/Fnew-A
ATG
TAA
pgl 1.2 Kb Digestion and ligation
Ca2+ 0.6 0 Fe3+ 0.6
1
5 20
107.2
110.7 130.9
11.3
10.8 13.1
23.5
21.6 21.2 Ca2+的促进作用最为明显, 浓度升高作用越为显著,添加 1mM、5mM和20mM ,PGL 胞外酶活分别提升0.17%、 13.5%和25.5%.
0
Mg2+ 0.6

2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素
2.2 氮源对工程菌生长与产酶情况的影响
氮源 对照-1 对照-2 胰蛋白胨 工业级蛋白胨 蛋白胨试剂 大豆蛋白胨 安琪酵母 酵母浸膏 牛肉浸膏 13% 12% 10% 11% 9% 10% 7% 8% 28 30 36 32 40 36 51 45 含氮量 添加 干重 PGL酶活 氮源
精练
Scouring
漂白
Bleaching
淀粉酶/PVA降解酶
角质酶/碱性果胶酶
过氧化氢酶
环境污染和能源危机 纺织工业高污染、高能耗
角质和果胶质
生物法节能、水,低污染 提高产品质量
国内外碱性果胶酶基因工程菌研究情况
宿主
载体
培养策略
发酵 时间 (h)
120
DCW (g L-1)
安琪酵 母粉(g) 36 27 24 18 12 9 0
蛋白胨 试剂(g) 0 8.2 10.9 16.4 21.8 24.5 32
DCW (gcell L-1) 18.1 23.7 27.5 22.9 19.7 16.5 13.8
PGL酶活 (U ml-1) 8.7 9.3 12.7 14.2 13.9 11.9 9.9
2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素
IPTG添加浓度对PGL分布的影响
条带1,2,3 (cs):胞外组分 条带5,6,7 (si):胞内与周质可溶组分 条带8,9,10 (ii):胞内与周质不溶组分
随IPTG浓度由0升至400 μM,相同生物量对应的不溶性包 涵体逐渐增加. 其浓度为50 μM时,可溶目的蛋白比例较高.
Extracellular PGL activity
, intracellular PGL activity
, DCW
.
22 oC诱导时 ,PGL胞外酶活仅8.5 U ml-1,分泌率为47.7%,均为5者中最低. IPTG对菌体生长有一定抑制作用,与对照相比,菌体干重下降约15%. 30 oC时,细胞干重13.6 g L-1,分别是22 oC和26 oC 诱导的1.57倍和1.22倍. 当IPTG浓度超过20 μM,PGL总酶活反而降低. 然而,高生物量并没有带来高产量. 26 oC诱导达到蛋白合成与转运最佳平 -1,是 30 oC时的1.39 50 μM IPTG时 总酶活最高 ,达到 U mL-1,66.4%. 胞外分泌率76.8%. 衡添加 ,胞外酶活 65.8U ml,PGL 倍,165.82 胞外分泌率达
可在高pH条件下以反式消去作用断 开果胶聚合物主链,裂解产物为△4:5 不饱和的寡聚半乳糖醛酸
不同来源的PGL分子量差别较大,范围为2374kDa,最适pH 为8-11,其生化特性的差异可 能是多种形式果胶存在的原因
碱性果胶酶概述 纺织品前处理的酶法工艺流程
上浆
Singeing
退浆
Desizing
PL(43kDa)
25.0
18.4
研究思路
菌体生长 目的蛋白表达量 分泌比率
原核宿主表达体系
大肠杆菌
枯草芽孢杆菌
摇瓶水平 1. 碱性果胶酶基因在大 肠杆菌中的克隆与表达 2. 影响重组大肠杆菌胞 外生产PGL的关键因素
发酵罐水平 3.1 重组大肠杆菌两阶 段甘油流加策略的研究 3.2 流加培养过程诱导 时机的研究
0.1
1 5 20
83.9
101.3 105.9 120.6
4.7
10.6 11.0 12.6
10.2
14.9 13.1 10.5
2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素
Induction at 26℃ led to a better coordination 2.4 诱导条件重组 PGL胞外生产的影响 between protein synthesis and translocation PGL productivity was the highest at around 50 μM of IPTG
摇瓶水平 4. 碱性果胶酶基因在 枯草芽孢杆菌中的表达 5. 重组碱性果胶酶 粗酶性质的初步研究
2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素
2.1 初始培养基的选择
Culture media
LB 2×YT SOC TB
DCW (gcell L-1)
4.8 5.8 7.4 11.5
Extracellular activity (U ml-1)
重组大肠杆菌的分泌表达
表达 系统 特性
培养基组成
异源蛋白 分泌表达
过程 控制 策略
诱导后流加策略
流加策略 诱导方法
VS
异源蛋白分泌表达
目的蛋白 自身特性
重组大肠杆菌 培养基组成
胞外PGL
包涵体
胞内PGL 诱导后流加策略
异源蛋白 分泌表达
过程 控制 比产率 策略
生物量
pET22b(+)
DO-stat 甘油流加 培养温度37 oC
13
8
37 a,b, ex
2.8
原核表达体系
• 酶活水平高 • 工艺流程简单 • 发酵周期短
pET28a(+)
摇瓶发酵 诱导温度20 oC
60
N.S.
360 b,in
6.0
pHsh
分批发酵 温度诱导型菌株
25
20
22 ex
0.9
(Zhuge et al., 2007)
流加策略 诱导方法
VS
异源蛋白分泌表达
After
胞外PGL 包涵体 胞内PGL
目的蛋白 自身特性
Before
研究思路
菌体量 比生产 分泌比率
原核宿主表达体系
大肠杆菌
枯草芽孢杆菌
摇瓶水平 1. 碱性果胶酶基因在大 肠杆菌中的克隆与表达 2. 影响重组大肠杆菌胞 外生产PGL的关键因素
发酵罐水平 3.1 重组大肠杆菌两阶 段甘油流加策略的研究 3.2 流加培养过程诱导 时机的研究
P. pastoris X-33 P. pastoris GS 115
Invitrogen
摇瓶发酵
N.S.
山梨醇和甲醇
Invitrogen
混合流加 低温诱导
96
143
1593 to
16.7
E. coli BL21 (DE3) E. coli Turner (DE3) plac I E. coli JM109
PGL 生产 酶活 参考文献 强度 -1 -1 -1 (U ml ) (U L h )
20 to 0.2 (Liu et al., 2006) (Wang et al., 2010) (Matsumo to et al., 2002) (Zhao et al., 2007)
毕赤酵母
• 发酵周期长 • 工艺流程复杂 • 低温诱导能耗高

继续增加甘油含量对菌体生长和PGL合成影响不明显 . 但以葡萄糖为碳源时工程菌产酶不稳定 .
2. 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL的关键因素
2.3 金属离子对重组大肠杆菌生长与PGL合成的影响
Metal ions Adding Concentration Mode(OD600) (mM) Extracelullar PGL(U ml-1) Intracelullar PGL(U ml-1) Biomass (OD600)
克数(g)
(gcell L-1)
12.25 10.2 7.8 8.4 9.9 11.1 8.7 9.1 11.3
(U ml-1)
26.38 15.8 3.7 4.3 13.8 10.3 18.1 9.7 7.32
种类
分子级 分子级 试剂级 工业级 试剂级 试剂级 工业级 试剂级 试剂级
酵母粉: 蛋白胨 1:0 3:1 2:1 1:1 1:2 1:3 0:1
7.9 10.4 13.7 28.7
Specific productivity (U gcell-1)
1.6 1.7 1.8 2.5
Secretion capability (%)
37.9 32.6 42.6 54.8
SB
12.1
25.9
2.1
53.9
采用在TB培养基作为发酵培养基,胞外PGL酶活到达28.75 U ml-1,分别是LB培养 基的3.6倍和SB培养基的1.1倍.TB培养基和SB培养基中,比生产率(胞外酶活/DCW) 和分泌率(胞外酶活/总酶活)基本相当,LB、2×YT和SOC培养基稍低 .