实时荧光定量PCR原理
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数 方式增加的，随着反应循环数的增加，最终 PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入 平台期。
在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧 光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此 用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。
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利用电泳定量
荧光定量PCR检测技术
（FQ-PCR, Fluorescence quantitative PCR）
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实时荧光定量PCR技术
所谓real-time FQ-PCR技术，是指 在PCR反应体系中加入荧光基因，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进 程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。
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（一）选择靶基因
TaqMan技术主要用于检测，所以其扩增 的基因必须是特异的，如：
某种病原微生物所共有的保守基因 （检测某种病原微生物）；
某个血清型所特有的基因序列 （区分检测某个血清型）；
选择决定毒力强弱的基因 （区分强毒和弱毒）.等。
（二）选择探针
选择探针需要同时满足以下条件： 1、在靶基因的保守区域 2、G+C含量在40%以上； 3、相同碱基连续不超过4个；
4、Tm值在71±2℃;
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（二）选择探针
5、内部自身配对较少； 6、5’端不为G； 7、G数目比C数目少；
如果6和7难以满足的时候，就要考 虑用互补序列作探针。
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（三）选择引物
探针选好之后，在探针的上下游分别选 择合适的引物序列，引物应满足如下的 条件:
1、在靶基因保守和无二级结构的区域； 2、与探针所在区域不重叠；
11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference
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实时荧光定量PCR原理
在real-time Q-PCR中，对整个PCR反 应扩增过程进行了实时的监测和连续地 分析扩增相关的荧光信号，随着反应时 间的进行，监测到的荧光信号的变化可 以绘制成一条曲线。
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标准曲线
如何定量
未知样品的C(t) 值
定量
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荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分 为两种：荧光探针和荧光染料。
荧光探针：TaqMan荧光探针 荧光染料：SYBR荧光染料
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一、TaqMan检测技术原理
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入 一个特异性的荧光探针，该探针为一寡 核苷酸，与扩增片断内部某一段系列相 同或互补，两端分别标记一个报告荧光 基团和一个淬灭荧光基团。
光发射或者以热量形式散失
探针、引物与目的片段结合，FRET
Light Emission
Taq
Taq 水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离
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TaqMan检测技术的设计
与普通PCR的设计基本相同，区别 在于引物与探针的设计一般需要特 定的软件，如美国ABI公司开发的 Primer Express软件。
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探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切 酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬 灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到 荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产 物形成完全同步。
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TaqMan检测技术
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是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂 交技术相结合的定量PCR方法。
PCR的高效扩增特性ຫໍສະໝຸດ 核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性
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实时荧光定量PCR
定义
利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控
目的
对起始模板进行定量
优点
灵敏，重复性，动态范围宽，高通量
原理
Ct 值与起始模板浓度的对数成. 比例
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实时荧光定量
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
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实时荧光定量PCR原理
利用已知起始拷贝数的标准品可作出 标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝 数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要 获得未知样品的Ct值，即可从标准曲 线上计算出该样品的起始拷贝数。
Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域
值时所经历的循环数。 .
什么是C(t)值
C(t)
Threshold（域值）
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为什么要引入C(t)值
96 replicates of B7 gene molecular beacon
Ct
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Endpoin
实时荧光定量PCR原理
研究表明，每个模板的Ct值与该模 板的起始拷贝数的对数存在线性关 系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
原理示意图
荧 光
完好探针
荧 光 淬
物
上P游C引R物扩增前 质
灭 物
质
模板负链
DNA合成
PCR扩增时
探针水解，释放荧光
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TaqMan®
Donor dye (Reporter)
Acceptor dye (Quencher)
探针
未结合的探针
Light Taq Light
Energy transfer
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（三）选择引物
3、与靶基因其他区域配对较少； 4、G+C含量在40%以上； 5、相同碱基连续不超过4个；
6、Tm值比探针Tm值低10±1℃;
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（三）选择引物
7、探针与两条引物之间的各种组合形成 的二聚体都较少，特别是引物3’端与探针 配对很少；
8、PCR扩增片断在70—250个碱基之间。 如果找不到合适的引物，可调整探针（向
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实时荧光定量PCR原理
在PCR反应早期，产生荧光的水平不能 与背景明显地区别，而后荧光的产生进 入指数期、线性期和最终的平台期，因 此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推 断模板最初的含量。
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实时荧光定量PCR原理
为了便于对所检测样本进行比较，在real-time QPCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值 （threshold）。
以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号 （baseline），荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
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实时荧光定量PCR原理
如果检测到荧光信号超过域值被认为是 真正的信号，它可用于定义样本的域值 循环数（Ct）。