PCR引物设计基本思路1.根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询RBS 149..153/gene="eryF"CDS 158..1372/gene="eryF"1 ggatcccgat cgtgtcggag g aa gaggcc a agtcgcgccg ccc cgaccag ctgctggtgc61 tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg121 gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgt atg acgaccgttc ccgatctcga181 aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc241 ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc301 gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt361 ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac421 caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga481 gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct541 gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct601 gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg661 gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc721 ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg781 cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc841 cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag901 cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccacccg gaccagctcg cgctggtgcg961 gcgggacccg tcggcgctgc ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc1021 ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca1081 gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga1141 cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggcagggcat1201 ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct1261 gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg1321 ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacgga t ga gcacctgg1381 ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg1441 ggagccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg1501 cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc1561 ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc1621 gccctg ttcg ggcacagcat g ggcgcg ttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa1681 cgcgagcccg gcggcgggcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg1741 cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc1801 ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg1861 cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcgg acggaccacc gctgcgggcc1921 ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac ccgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc1981 tggttgcagc actcggtcat ccccggccgg accaggacct tccccggcgg gcacttctac2041 ctgggtgaac aggtcaccga ggtggccggt gccgtgcgcc gggacctgct acgcgccggg2101 cttgcgggct gaggcgatca cgaagtcgag cgcgggcagc tcgcccttca tgcccgagtc2161 gctggtcagc gaccgcttga cctggctgta gaagagcctg ctcacgctct tcttgaacga2221 ctcgtcctgc aggcacctgg ctg2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。
所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。
这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。
并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点（generuner分析）。
3.初步确定设计的引物长度。
一般为15～30bp，引物过短会影响到扩增的特异性，过长会影响扩增速率。
如果扩增产物≤500bp，引物长度为16～18bp即可。
若扩增产物为4～5kb，引物最好不要少于24bp。
引物3’末端应含有所研究基因特异序列中的17～30bp。
4.5正向引物的设计：4.1 酶切位点的位置选择。
一般情况下都需要在引物的5’，3’端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。
A：扩增的DNA用于表达时：（1）自身有启动子。
如：LOCUS VITVHBA 689 bp DNA linear BCT 26-APR-1993 DEFINITION Vitreoscilla sp. hemoglobin (VHb) gene, partial cds.ACCESSION M30794 M31721 X13516VERSION M30794.1 GI:155319KEYWORDS hemoglobin; promoter region.SOURCE Vitreoscilla sp.ORGANISM Vitreoscilla sp.Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales;Neisseriaceae; Vitreoscilla.REFERENCE 1 (bases 42 to 689)AUTHORS Khosla,C. and Bailey,J.E.TITLE The Vitreoscilla hemoglobin gene: molecular cloning, nucleotidesequence and genetic expression in Escherichia coliJOURNAL Mol. Gen. Genet. 214 (1), 158-161 (1988)MEDLINE 89143453PUBMED 3067078REFERENCE 2 (bases 1 to 210)AUTHORS Khosla,C. and Bailey,J.E.TITLE Characterization of the oxygen-dependent promoter of theVitreoscilla hemoglobin gene in Escherichia coliJOURNAL J. Bacteriol. 171, 5995-6004 (1989)COMMENT Original source text: Vitreoscilla sp. DNA.SWISS-PROT; P04252; BAHG$VITSP.FEATURES Location/Qualifierssource 1..689/organism="Vitreoscilla sp."/mol_type="genomic DNA"/db_xref="taxon:60"misc_signal 33..40/note="promoter 2"-35_signal 55..61-10_signal 73..79misc_signal 86..92/note="promoter 1"RBS 130..133/note="putative ribosome binding site; putative"CDS 142..582/note="hemoglobin"/codon_start=1/transl_table=11/protein_id="AAA27585.1"/db_xref="GI:155320"/translation="MLDQQTINIIKATVPVLKEHGVTITTTFYKNLFAKHPEVRPLFDMGRQESLEQPKALAMTVLAAAQNIENLPAILPAVKKIAVKHCQAGVAAAHYPIVGQELLGAIKEVLGDAATDDILDAWGKAYGVIADVFIQVEADLYAQAVE"ORIGIN1 aagcttaca g gacgc tgggg ttaaaagtat ttgagttttg atgtggatta agttttaaga61 ggcaataaag gtgctgctac accatactga tgtatggcaa aaccataata accatactga121 atgaactta a gga agaccct c atg ttagac cagcaaacca ttaacatcat caaagccact181 gttcctgtat tgaaggagca tggcgttacc attaccacga ctttttataa aaacttgttt241 gccaaacacc ctgaagtacg tcctttgttt gatatgggtc gccaagaatc tttggagcag301 cctaaggctt tggcgatgac ggtattggcg gcagcgcaaa acattgaaaa tttgccagct361 attttgcctg cggtcaaaaa aattgcagtc aaacattgtc aagcaggcgt ggcagcagcg421 cattatccga ttgtcggtca agaattgttg ggtgcgatta aagaagtatt gggcgatgcc481 gcaaccgatg acattttgga cgcgtggggc aaggcttatg gcgtgattgc agatgtgttt541 attcaagtgg aagcagattt gtacgctcaa gcggttgaa t aa agtttcag gccgctttca601 ggacataaaa aacgcaccat aaggtggtct ttttacgtct gatatttaca cagcagtttg661 gctgttgcca aaacttggga caaatattg①扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启动子前面。