（五）固定时的注意事项


1. 标本 应新鲜并及时取材，快速放入固定液中。 特殊标本应单独固定和存放。 2. 固定液的用量 一般固定液用量为组织块体积的 10~20倍，贵重的固定液不少于3~5倍。避免组织紧 贴容器底部，影响固定效果。对于特殊染色的组织 (如神经染色及酶组织化学染色等)固定时应考虑组 织块的大小、固定液种类、固定时间和温度等。酶 组织化学染色组织的固定应置于冰箱4℃固定。
二、冰冻组织的取材及保存方法 （一）取材

负责诊断的医师应亲自检查大体标本，做多 切面详细检查，必要时可在解剖镜下观察。 选取最具代表性的组织制片，必要时应多点 取材。如切面有特殊要求，应向技术人员说 明。取材和切片的剩余组织须进一步做石蜡 切片进行对照，有利于病理医师对照阅片， 不断提高观察冰冻切片的水平。

2. 混合固定液 (1) Bouin液 ：用于结缔组织及脂肪染色； (2) Zenker液：常用于三色染色； (3) 4%多聚甲醛-磷酸二氢钠-氢氧化钠液；

（四）固定后的处理

1. 一般固定液(甲醛等)固定组织后，用流水冲洗以清除组 织内的固定液终止固定。 2. 含有乙醇、乙酸及苦味酸的固定液，组织固定后不需 要或不能用水冲洗。 3. 含有铬酸、重铬酸钾和锇酸的固定液，组织固定后应 充分水洗，一般为12~24h。 4. 用含汞的固定液固定组织后，要进行脱汞处理，可在 组织脱水前或切片染色前进行，一般多在染色前脱汞。其 方法为切片脱蜡入水后，入0.5%碘乙醇5~10min，水洗 后再入3%~5%硫代硫酸钠或95%乙醇1~2min，再充分水 洗，蒸馏水洗后进行染色。

3. 切片时刀是由下向上运动，为得到完整的切片， 防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部 分放在上端(如皮肤组织的表皮部分，胃肠等组织 的浆膜面等)。 4. 捞片时注意组织片的摆放位置，尽量整齐美观。 要留出贴标签的空间， 5. 捞片时注意在切片和玻片之间不要留有气泡。 捞好的切片应在60℃左右烤箱内烤至少30min。 以防染色时脱片。
a平凹形
b深平凹形
c平楔形
d双凹形
各种切片刀的剖面图
石蜡切片机用一次性钢刀片
二、组织切片(Tissue sectioning)
石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中
最常用、最普遍的一种方法。
(一)切片前的准备
1. 备齐常用器具, 如玻片、毛笔和铅笔或 刻字笔。 2. 检查切片机的工作状态, 将固件都拧紧， 检查切片刀是否锋利, 切片刀质量是保证 切片的关键。如果使用一次性刀片, 应根 据切片情况及时调整刀刃位置。

用熔化的切片石蜡逐渐替换组织中 二甲苯的过程。
六、组织的包埋和包埋方法
(Embedding)
（一）常规石蜡包埋 （二）脱落细胞标本的包埋 （三）微小标本的包埋

第二节 组织切片法 (Tissue sectioning)

组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火 棉胶切片法、树脂包埋薄切片法和大组织石蜡 切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、 切片刀和自动磨刀机等。
一、取材(Samples collection)
1. 人为因素 2. 标本大小 3. 取材时间 4. 包埋方向 5. 边缘标记

6. 小标本的处理方法 7. 特殊情况取材 8. 取材数量 9. 清除多余成分 10. 重复取材 11. 核对取材 12. 剩余组织存放

（二）常用的固定方法
1. 浸泡固定法 2. 灌注固定法 3. 细胞涂片的固定方法 4. 微波固定法 5. 蒸气固定法

（三）常用的固定液
1. 单纯固定液 (1) 甲醛(formaldehyde) (2) 酒精(alcohol) (3) 苦味酸(picric acid) (4) 丙酮(acetone) (5) 醋酸(acetic acid)
（二）切片制作过程
1. 蜡块在冰箱中预冷，然后固定在切片机上。将 切片刀装在刀架上。调整蜡块与刀的位置，使蜡 块切面与刀刃接近。 2.切片机多为轮转式，使用时左手执毛笔，右手 旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴 露于切面为止，标本过小时修块应多加注意，大 标本要切全。切出蜡带后，用毛笔轻轻挑起一端， 用镊子夹起另一端，正面向上放入展片水槽中(水 温一般低于蜡熔点10~12℃)，待切片展平后，即 可进行捞片。

（2）盖玻片的处理：盖玻片可按以上方法处理， 但因盖玻片很薄，以上处理程序应缩短。清洁液 浸泡2h，流水冲洗。也可用以下方法清洗:盖玻片 立排于卧式染缸(排2行，中间隔以载玻片)。松紧 度以玻片可轻松转动为好，以下步骤应保持液体 进入每个玻片间隙，玻片之间不能有气泡。用 1%盐酸酒精浸泡2h，然后流水冲洗干净，再用 蒸馏水冲洗数次。入95%酒精浸泡2~3h，无水酒 精浸泡20min，倒掉酒精放60℃烘箱烤干备用。
Notice
1.上课请关手机（或调成振动，接电话到室 外）。 2. 选修课自愿选择，试听一次，下次课班 长提交选修课学生名单(包括email)。 3. 学分问题 ⑴ 平时表现 如：纪律、问答、作业。 ⑵ 结课测验? ⑶ 对本课程的意见和建议；
生命科学研究中心 邢立强 emxlq@
3.
防止组织变形 柔软或较薄的组织先平铺在吸水 纸上，再投入固定剂中；含气或脂肪多的组织易浮 于液面，可在组织表面覆盖棉花以达到充分固定。 4. 固定液的穿透性 一般固定液在24h内不能穿透 厚度大于2~3mm的实体组织或5mm的多孔疏松组织， 故取材组织块的厚度原则上不应超过3~4mm。 5. 固定时间 固定的时间与固定液的种类、组织类 型、块大小、温度等有关。一般1.5cm×1.5cm×0.2 ~0.3cm大小的组织块, 固定时间为12~24h。 6. 固定温度 大多数可在室温(25℃)固定，在低温 (如4℃)固定时，固定时间要相应延长。
（二）保存方法
组织速冻的方法很多，常用方法为液氮和干冰 ~丙酮法。 1. 液氮法：将组织块平放于瓶盖或标本盒等适 当容器内，缓慢放入盛有液氮的容器内。当组 织块冻结后，取出用铝箔包好，做好标记后入 液氮罐或-70℃低温冰箱保存。可保存数月至数 年。如短期内使用，可保存于-30℃冰箱。


2. 干冰-丙酮法：将组织块放入盛有OCT包埋 剂的标本盒内，使组织块完全浸没。将丙酮倒 入盛有10g干冰的保温杯调成糊状。将装有组 织块的标本盒放入保温杯，待包埋剂成白色冻 块时，取出如上法保存。此法组织速冻快，组 织结构保存好。
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目的和要求
Aims and Requirements
了解生物组织的特点及取材的注意事项； 熟悉切片的原理、一般要求及注意事项； 掌握石蜡切片制作技术；

病理学常用的观察手段
The common survey means in pathology
1、大体标本观察：主要用肉眼、量尺及各种衡 器等辅助工具，对所检标本的大小、形状、色泽、 重量、表面及切面、病灶特点进行观察及测量。 2、组织切片的观察：取正常或病变组织进行切 片、染色(HE染色最常用)在显微镜下进行观察。
三、脱水(Dehydration)
组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡 不能混溶。因此在浸蜡和包埋前，必须进行 脱水。 常见的脱水剂有乙醇、正丁醇、丙酮等。 为防止水份丢失过快，造成组织变形，一般 采用梯度脱水法。也就是使脱水剂的浓度逐 渐升高，脱水过程尽量缓和，减少组织变形。

四、透明(Transparentizing)
病理技术的应用
Application of pathologic technique
帮助临床查明死因(尸检); 手术后病变标本，明确诊断(临床活检); 为教学、科研提供资料;
第一节 组织处理 Tissue processing
Hale Waihona Puke 取材(Sample collection)→固定(Fixation)→ 脱水(Dehydration)→透明(Transparentizing) →浸蜡(Paraffin soaking)→包埋(Embedding)

二、固定(Fixation)

固定就是用物理或化学方法，阻止组织细胞离体 或培养细胞脱离生存环境后发生形态学变化。
(一)固定的目的
1. 迅速阻断组织细胞离体后的自溶性变化，防止 腐败，尽量保持组织细胞生活状态下的形态结构。 2. 使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变 成不溶性物质，并保持原有的空间位置。 3. 固定剂有硬化作用,增加组织的硬度,便于制片。 4. 组织中的各种物质经固定后产生对染料的亲和 力，利于染色和观察。
一、冰冻切片法


（一）恒冷箱切片机 提前开机预冷，一般工作温度设定在-22℃左右。 待刀台、样品台和箱内达到设置温度后即可切片。 顺序如下：①将组织用OCT粘在样品托后放置在速 冻台上；②组织冻结后，将样品托固定到样品台上； ③调整组织切面与刀刃位置，初步修出组织切面后， 放下防卷板，关闭观察窗，开始切片。④切出的切 片粘贴到载玻片上，直接冻存或吹干固定。 （二）半导体制冷切片机
常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、环己 酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等。 目前也有用环己酮作为透明剂，环己酮为无色无 毒液体，可与苯、二甲苯和酒精等相混合，也可 溶解石蜡。而且脱水时组织不收缩变硬，用于快 速石蜡切片效果较好。

五、浸蜡(Paraffin wax soaking)

病理学标本的种类
Types of pathologic samples
1、活体组织检查(Biopsy)：简称活检，从患者 活体局部切取、钳咬、细针吸取和摘取等手术 方法获取病变组织进行病理检查。 2、脱落细胞学检查(Exfoliative cytological exam)：对患者痰液、胸腹水、尿液以及阴道刮 片、食管拉网、纤维胃/支气管镜所取得的材料 进行涂片，以检查脱落细胞，是早期发现和诊 断肿瘤的好方法。