1.PCR反应体系包括哪些内容？基本反应过程是什么？内容：模板、引物、TaqDNA聚合酶、原料、Mg2+、缓冲液、双蒸水基本反映过程：变性——退火——延伸——检测DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 退火（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
检测2.限制性内切酶的活性受什么因素的影响？①DNA分子的纯度②限制酶的浓度③DNA分子的构型④DNA分子的甲基化程度⑤酶切反应的时间与温度⑥缓冲液的选择3.作为基因工程载体的条件是什么？1)具有一个或多个限制酶切点,以供外源基因插入其中;2)具有标记基因,以鉴定重组是否进入受体细胞;3)能自我复制,否则可能导致重组丢失;4)对受体细胞无害;5)大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大不便操作.4.基因工程诞生的理论基础是什么？、20世纪中三个基础理论的重大突破,是基因工程的诞生的理论基础.1、DNA是遗传物质的证明.2、DNA双螺旋结构和中心法则的确立.3、遗传密码的破译.技术上的三大发明*（3酶2体）1.限制性核酸内切酶的发现与DNA切割2.DNA连接酶的发现与DNA片段的连接3.载体的研究与应用5.构建载体的一般过程是什么？A目的基因的分析1.开放阅读框分析2.酶切位点分析B载体的选择与分析1.多克隆位点分析2.标记基因分析3.启动子及其他筛选标记分析C连接体系与连接时间的确定6.大肠杆菌作为基因工程受体菌的优点与缺点？优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子生物学等方面背景知识清楚。
并且大肠杆菌已经发展成为一种安全的基因工程试验体系，易于批量生产。
缺点：在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子;细菌不具有对真核基因的蛋白进行修饰的机制，导致真核基因表达出的蛋白无法表现活性；外源真核基因表达的蛋白往往被细菌当作异己给降解掉7.如何有效提高外源基因的表达效率？提高外源基因表达效率的途径有很多，可以归纳如下：⑴提高启动子强度。
⑵缩短启动子同克隆基因间距离。
⑶高效的翻译起始序列。
⑷高效的转录终止区。
⑸提高质粒拷贝数及稳定性。
⑹用以下方法提高翻译水平：①调整SD序列与AUG间的距离；②用点突变的方法改变某些碱基；③增加mRNA的稳定性的。
⑺减轻细胞的代谢负荷：①诱导表达；②表达载体的诱导复制。
⑻提高表达蛋白的稳定性，防止其降：①克隆一段原核序列，表达融合蛋白；②采用某种突变菌株；③表达分泌蛋白质。
8.RACE技术原理与方法RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，利用锚式PCR，快速扩增cDNA末端从而获得已知mRNA内一段小序列与3‘或5’的cDNA序列技术。
9.3’RACE技术原理与方法利用mRNA的3' 末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART 寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。
10.5’RACE技术原理与方法先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5' 末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头（见下图）。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM （universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。
11. 理想质粒载体的必备条件①能在宿主细胞中进行独立和稳定的自我复制②具有合适的限制性酶切位点③具有合适的选择标记基因1.有较小的分子质量与较高的拷贝数2.具有两种以上的选择标记基因3.缺失MOB基因（不懂）4.插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞进行自我复制和表达12.核酸操作的基本技术有哪些？①核酸的提取与纯化②核酸的检测与保存③核酸的凝胶电泳④核酸的分子杂交13.合成cDNA第二链的主要策略有哪些？①自身引导合成法②置换合成法③PCR合成法④RT-PCR⑤cDNA与载体连接14.PCR技术主要应用在哪些领域？①核酸基础研究②基因测序③检测基因表达④转基因检测⑤研究未知DNA片段15.真核基因在大肠杆菌中表达存在哪些障碍?①真核基因缺乏SD序列不能直接在大肠杆菌内部翻译②细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子;细菌不具有对真核基因的蛋白进行修饰的机制，导致真核基因表达出的蛋白无法表现活性③外源真核基因表达的蛋白往往被细菌当作异己给降解掉16.限制性核酸内切酶的命名原则？一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)17.影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？①DNA分子的纯度②DNA分子的构型③DNA分子的甲基化程度④酶切反应的时间与温度⑤缓冲液的选择18.什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有何作用？Klenow 酶KlenowFragment，又称Klenow片段，是大肠杆菌聚合酶I的大片断。
保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。
由于其失去了降解5’端引物的活性，所以在基因工程中更有用1.修复反应，制备平末端2.制备3’标记探针19.若已知某基因的功能及其相应的蛋白质核苷酸序列，可通过哪些办法克隆该基因？可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库中筛选。
或利用相应抗体从cDNA文库中克隆20.YAC载体有什么样的功能性序列？为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。
YAC能容纳长达几百KB的外源DNA。
大片段的插入更有可能包含完整的基因，增大染色体的步移距离，减少所需克隆数目21.什么是western印迹，其与southern印迹又何不同？Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异的抗体进行检测。
他与southern的不同在于探针性质的不同，在western中使用的探针为抗体（蛋白质）22.什么是蓝白斑筛选法？蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法。
野生型大肠杆菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。
5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。
突变型大肠杆菌缺少完整的β-半乳糖苷酶，在含有互补片段质粒作用下，可形成完整的β-半乳糖苷酶，插入外源基因的质粒则破坏了半乳糖苷酶的编码，从而通过颜色变化筛选重组子。
这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。
主要是在λ载体的非必要区段插入一个自带有大肠杆菌β半乳糖苷酶的基因片段，携带有LAC基因片段的λ载体转入宿主后·，在含有X-gal平板上形成浅蓝色噬菌斑。
外源基因插入LAC 后，丧失分解Xgal的能力，形成白色噬菌斑。
便于筛选23.粘性末端链接法的不足①载体易自身环化②难插入特定基因③大片段DNA重组率低④同一种限制酶产生的黏性末端不易定向克隆24.什么是同聚物加尾连接法？有哪些优缺点？同聚物加尾法是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏粒末端，DNA与载体间要加上互补的dT优点①不易自身环化②链接效率高，因为是互补的黏性末端任何一种方法制备的DNA都可用此法连接缺点①繁琐②尾巴影响基因表达25.重粗DNA技术有哪些基本步骤？①获得目的基因②与克隆载体连接③转化④对转化子筛选与鉴定⑤培养或的产物26.获得目的基因常用的方法有哪些？①从基因文库中提取②PCR技术③人工合成27.常用的抗生素标记有哪些？氨苄青霉素抗性基因ampr 四环素抗性基因tetr 氯霉素抗性基因cmr 卡那霉素和新霉素抗性基因kanr28.琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？DNA电泳常用的支持介质有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶.琼脂糖凝胶的凝胶孔径大，适合大分子DNA电泳和需要快速简单分析的DNA电泳，电泳方式一般采用水平潜水电泳。
优点是快速简单，但分辨率不是很高，对于差异较小的 DNA片段难以分辨。
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离.一般说来，分离鉴定小于1000个核苷酸的核酸片段可用聚丙烯酰胺电泳，分离鉴定0.1-50kb的DNA片段可用恒场常规琼脂糖电泳，而分离鉴定大于50kb的DNA片段则需采用脉冲场琼脂糖电泳。
29.构建cDNA文库的一般步骤①mRNA的分离纯化②cDNA的合成③cDNA与载体连接④噬菌体颗粒包装及导入宿主细胞中繁殖30.DNA双脱氧链终止测序法的基本步骤原理：双脱氧的核苷酸是人造的分子，这种分子糖环的2’和3'碳上都没有了羟基基团，而在天然分子中糖环的3'碳上有一个羟基。
在DNA复制过程中，新掺入的碱基按碱基互补配对原则是天然三磷酸核苷酸，用它的5'-α-P同生长链的前一个核苷酸的3'羟基连接。
但是，若进入的核苷酸是双脱氧的，则由于3'没有羟基而影响下一个磷酸二酯键的形成，导致DNA复制终止。
方法：将待测序的单链DNA的模板、引物、四种单脱氧碱基和DNA聚合酶分成四管，在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。