基因芯片技术的应用现状及展望1基因芯片1.1基本概念和原理又称DNA 微阵列、DNA 芯片, 通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建成的微型生物化学分析系统,能够通过检测基因的丰度来确定基因的表达模式和表达水平。

由于常用硅芯片或玻片作为固相支持物, 并且在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术, 所以称为基因芯片技术。

基因芯片的工作原理与核酸分子杂交的方法是一致的, 都是运用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列进行杂交, 然后通过信号检测进行定性和定量分析。

与传统的核酸杂交不同的是基因芯片是在一微小的片基如硅片、玻片和塑料片等表面上集成了大量的核酸分子识别探针, 能够在同一时间内平行分析大量的基因, 进行大量信息的筛选与检测, 实现对生物样品快速、并行、高效地进行检测或医学诊断。

1.2研究背景80 年代初, 科学家提出了固相核酸杂交的设想, Bains 等首先对固相杂交DNA 测序进行了有益的探索; 其后, 俄罗斯、美国及英国的科学家分别报道了用杂交测定核酸序列的方法。

1991 年, Affymetrix 公司Fodor 等建立了原位光刻合成技术, 为寡核苷酸在片原位合成制作高密度基因芯片奠定了基础, 标志着核酸检测技术已发展到了一个新的阶段。

1994年, 俄美科学家共同研制了用于B- 地中海贫血基因突变筛查的基因芯片, 测序的速度提高了近1 000 倍, 被认为是一种全新的快速测序方法。

鉴于基因芯片潜在的巨大商业价值, 90年代中期开始, 国外更多的商业公司加入了芯片开发的行列。

1996 年底, Affymetr ix 公司推出可应用的基因芯片和较完整的芯片制造、杂交、扫描及数据分析系统, 其它如GeneralScanning Inc、Telechem、Cartesian 等公司亦相继研制出芯片用激光共聚焦扫描仪及分析软件。

到目前为止, 芯片技术在基础研究, 尤其是在基因表达方面已得到应用, 而在医学应用方面也已开发出少数基因诊断等相关芯片。

但由于芯片和检测系统价格昂贵、专利及许多技术问题还有待解决, 因此目前尚未大规模的应用。

在我国, 较早从事基因芯片研究的机构有清华大学、复旦大学、东南大学等。

其中, 清华大学处于领先地位, 并得到国家重点支持。

其它如东南大学在分子印章法制备高密度基因芯片、复旦大学在硅导电玻璃介质生物芯片制备、西安超群公司在三维立体基因芯片制造等方面也都取得了一定成果。

1.3基因芯片的分型视分类方法不同可以分为以下几种主要类型：a．无机片基和有机合成物片基的基因芯片b．原位合成和预先合成然后点样的基因芯片c．基因表达芯片和DNA测序芯片另外根据所用探针的类型不同分为cDNA微阵列（或cDNA微阵列芯片）和寡核苷酸阵列（或芯片），根据应用领域不同而制备的专用芯片如毒理学芯片（Toxchip）、病毒检测芯片（如肝炎病毒检测芯片）、P53基因检测芯片1.4基因芯片核心技术1.4.1载体表面化学修饰基因芯片多以玻璃片为载体，由于玻璃片表面化学性质稳定，在连接上述各种活性基团之前，通常需要先进行硅烷化处理。

玻璃片的硅烷化使用硅烷化试剂，即硅烷耦合剂，是一种有机硅单体，具有两种以上不同反应基团，能起到把有机材料和无机材料进行化学耦合的媒介作用。

该类化合物一般具有RSiX3的化学结构，X表示水解基团，如甲氧基、乙氧基等，能与无机材料(玻璃、金属、二氧化硅)进行化学结合，R为有机官能团(如氨基、羟基、巯基等)，能与有机物质结合。

在玻璃片处理过程中，比较常用的硅烷化试剂有氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、硫丙基三甲氧基硅烷和N．氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷。

硅烷化的玻璃片可以进行活性基团的连接，不同活性基团连接方法略有不同。

修饰后的载体应该达到表面均匀一致，容易进行共价的或非共价的化学修饰，并且在荧光探针激光波长范围内有一个低的背景荧光。

探针制备探针的制备主要有两种方法：一种方法是原位合成，即直接在载体上原位合成探针，此种方法适合制作高密度寡核苷酸芯片；另外一种方法是通过PCR进行扩增。

模板的来源有两种：一是克隆化核酸片段，可以是序列信息保存在Gen—Bank等公共数据库中、商业出售的cDNA克隆、EST克隆，也可以是各个实验室从各种文库中筛选并保存下来的上述克隆；这些克隆化核酸片段经PCR扩增后即用作探针。

进行基因表达分析时，多数情况下采用此种cDNA探针。

同一生物体中不同基因之间的同源性可能较高，PCR产物应代表其最可变的区域。

另一种是基因组DNA，用特异性引物对其进行PCR扩增，得到需要的序列片段。

1.4.2靶序列荧光标记基因芯片技术首选荧光染料作为标记，主要是因为荧光染料具有操作简便、高稳定性、高灵敏度、高选择性等特点。

荧光标记方法有直接标记和间接标记法。

直接标记是利用反转录酶或PCR 反应将CyDye标记核苷酸直接渗入到样品中，这是最常用的一种标记方法。

其局限性是酶对于CyDye标记核苷酸的低渗入效率，大多数酶不能均匀地渗入Cy3和Cy5荧光素，杂交信号不均一。

Cy5的渗入效率通常不如Cy3高。

间接标记又称合成后标记，是将一个化学活性核苷酸类似物(氨基烯丙基一dUTP)在链合成中掺入到PCR产物或cDNA第一链中。

氨基烯丙基-dUTP与无修饰的dUTP掺入效率相似，得到的探针随后用CyDye的活性反应物进行“合成后标记”，该活性反应物与氨基烯丙基一dUTP结合。

这种标记方法的优点是能得到Cy3和Cy5更加均一的掺入和更强的信号。

基因芯片打印基因芯片的打印方式有两种，即原位合成法和合成后交联法。

原位光刻合成技术系Affyrmetrix公司的一项专利技术。

运用这种方法制作的芯片探针密度可达106／cm2，即探针间隔为5～10Ⅱm。

用这种方法制备的基因芯片需要预先设计、制造一系列掩膜，造价昂贵；制造过程中采用光脱保护法，掩膜孔径较小时会发生光衍射现象，制约了探针密度的进一步提高；光脱保护不彻底，每步产率只有92％～94％，因此这种方法只能用来合成30 nts左右的寡核苷酸探针。

Gasson等¨]利用投影电视中的数控微镜阵列技术制造了一种无需掩膜的高密度芯片原位合成系统—MAS(maskless array synthesizer，～MAS)。

用这种方法可以在1．4 cm2的区域合成480 000种探针，单个探针的区域为16 ptm2}采用分辨率更高的DMAS(digital maskless array synthesizer，DMAS)，可以在同样大小的区域合成2 000 000种探针。

如果40种探针代表一个基因，就可以在一种芯片上合成相当于50 000个基因的探针。

合成时间比光控原位合成大为减少，合成成本也大为降低。

与原位合成法相比，合成后交联法比较简单，只需要将预先制备好的寡核苷酸、cDNA或PCR产物等样品通过自动点样装置点于经过特殊处理的玻璃片或其他材料上即可，合成后交联法适用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。

合成后交联法有两种点样方法：非接触式喷墨点加法和接触点加法。

非接触式喷墨点加法是由Biodot公司开发的。

目前非接触式喷墨打印基因芯片有两种技术，一种是压电打印技术，陶瓷材料的压电晶体紧密环绕玻璃毛细管(内含核酸片段)，通电后压电晶体变形，挤压毛细管，使液滴从毛细管的喷口喷射出来，每次喷射量为50～500 pL；另一种为注射泵一螺线管技术，将一个高分辨率的注射泵与高速微螺线管阀相连，同时通过一个开关阀门连接一个储液器。

抽拉注射泵使样品向上吸入管头，然后回压注射器对系统施加压力，打开微螺线管阀，喷出液滴，每次喷射量为4～8 nL。

压电打印技术上样量小，但是稳定性和定量性不如注射泵。

1.4.3基因芯片杂交基因芯片杂交属于固液相杂交El-g]，标记的靶分子与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交，影响杂交效率的因素主要有固定在芯片上的探针数、靶分子浓度、杂交双方的序列特性、杂交体系中的盐浓度、杂交的温度及杂交液的pH值等。

在杂交体系中，基因芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度，这对于获得正确可信的实验结果十分重要。

当基因芯片上的探针约10倍于靶分子浓度时，杂交反应为一级动力学方式，此时的杂交速率主要决定于探针浓度，探针浓度每提高一倍，信号将增强一倍。

．在杂交体系中，一价阳离子(如Na+)的存在可以提高异源杂交双链生成的速度，其原理是Na+可以屏蔽带负电荷的磷酸根骨架，通常在DNA芯片杂交时应用的Na+浓度为1mol／L，倘若杂交温度显著低于异源杂交双链的熔点时，温度对杂交速率有正影响，一般寡聚核苷酸芯片的杂交温度范围为25℃～42℃，而cDNA 芯片的杂交温度范围为55℃～70℃，但在用电离甲酰胺溶液为杂交体系时，则杂交温度为42℃。

杂交后的芯片需经严格的洗涤以去除未杂交的核酸片段及杂交缓冲液等，避免引起荧光背景。

1.4.4基因芯片扫描基因芯片扫描仪采用荧光检测，即利用激光激发掺入检测点中的荧光生色基团，读取荧光报告基团发出光信号，利用光电倍增管或电荷耦合器件(CCD)将其转化为电信号，然后通过软件将电信号还原成为图形或相关数据，最后通过分析所得数据给出检测报告。

目前商业化的基因芯片扫描仪主要有激光共聚焦芯片扫描仪和CCD芯片扫描仪两大类，其中前者使用最为普遍。

激光共聚焦芯片扫描仪采用激光作激发光源，使荧光生色基团产生高强度的发射荧光，用光电倍增管进行检测，灵敏度和分辨率较高，可检测每平方微米零点几个荧光分子。

其重复扫描的精度主要受X-Y移动平台的机械精度和环境条件的影响。

扫描仪常采用2种以上不同波长的激光器作为发光源，最多达4种，以激发不同荧光染料标记的靶分子。

常用的激光器波长范围可从488 am至近红外光区。

扫描得到的图像是黑白的。

多种荧光标记的芯片，可分别在不同波长的激光下重复扫描进行，也可在多个激发波长下，同时扫描即可得到多个波长的数据。

1.4.5基因芯片数据分析基因芯片分析主要包括数据采集、处理、分析和报告等环节。

芯片扫描仪对生物芯片扫描后，得到代表荧光强度的电信号，通过伪彩处理形成数字图像文件，因此必须经过图像处理提取各样品点的数据，才能进行统计分析，此过程借助专业图像分析软件完成。

图像的提取过程包括：图像的平滑过滤、图像背景的确定、样片斑点的识别、数据的提取、存贮与显示等。

得到的图像信息以数据库方式存储，需要建立管理系统，保存下列信息：芯片各点的基因名称、基因的碱基序列或功能的主要描述、GenBank存取码，图像克隆标记、代谢途径标记、内部克隆标记，芯片各点的荧光图像、背景值、光密度值等；还应有芯片的制备、实验环境条件、样品的类型和制备方法、实验目的和操作者姓名等信息。