2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。
② 内切酶粘性末端
能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I） (同尾酶)
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Sau 3A
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
2. 机械切割法
（1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断 裂成约300bp的随机片段。 （2）高速搅拌 1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb 的随机片段。
目前化学合成寡核苷酸大多数是在合成 仪上自动进行的，DNA自动合成已采用 的是固相磷酸二酯法和亚磷酸三酯法，
由于亚磷酸三酯法具有反应速度快，合
成效率高和副反应极少等优点，已经在 自动合成仪被广泛采用。
3、亚磷酸三酯法
(1)脱二苯甲基保护基 加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4— 二对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单 体1上的5’—OH。
AATTC G
EcoRI Adaptor
GAATTC CTTAAG
EcoRI Linker DNA合成仪
第三library）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片段，并将所有这些片段 都与适当的载体连接，引入相应的宿主 细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生 物体的全部基因，称为基因。第二节 化学合成目的基因
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法 合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。
一、目前常用的方法
磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法
1. 磷酸二酯法 （1）原理 ① 保护dNTP的3’端P和5’端–OH
BamH I BamH I
BamH I
gene
二、随机片段化
1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。
（1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数
影响所切出的产物的长度和随机程度。
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、Al体的要求
5. 合成人工接头或衔接物
含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔 接物（Linker）序列。
衔接物用化学合成法合成的一段10-12bp的特定 限制性内切酶识别位点序列的平端双链。
人工接头用化学合成法合成的一段不等长双链 DNA序列，一头平末端、另一头粘性末端，粘性 末端某种酶切所产生的粘性末端）。
合成的二核苷酸连接处有三个酯键！
固相磷酸三酯合成法 将第一个核苷酸的3’OH端固定在固相支持物 上。 是目前通用的合成方法。
固相磷酸三酯合成过程
C
固相支持物
固相 支持物
固相 支持物
Hale Waihona Puke 结果是全保护的DNA：5’ DMT(4，4-二对甲氧基三苯甲 基 ), 3’固相支持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护
起始脱氧单核苷酸
加入的脱氧单核苷酸
② 带保护的单核苷酸连接
带5’保护的单 核苷酸与带3’ 保护的另一个 单核苷酸以磷 酸二酯键连接 起来
③ 用酸或碱的脱保护
80%乙酸
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。
2. 磷酸三酯法
原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的 单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先 连接了一个保护基团。
第五章 目的基因的获取
目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
第一节 基因组DNA片段化
一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片段。
酶切
1. 优点
由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。
2. 缺点
目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
(5)氧化反应 形成的3’一5’磷酸二酯键由于磷为3价，即亚磷 酸酯，不稳定，能被酸或碱解离。加入I2将其氧化，使之转 化为磷酸三酯，其中磷为5价。
五价 三价
如此经过多次循环，直到合成所需长度 为止，再用浓NH4OH将DNA从固相上 洗脱下来，最后除去NH4OH ，在真空 中抽干，样品即可溶于适量的水中进行 纯化分析。
(2)活化新的碱基 核苷酸单体2 的3’端的二异丙基亚磷酸酰 上的磷酸的OH用β-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基 进行反应。
(3)缩合反应 在弱强——四唑的存在下，新加入带保护基的 核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3’，5’—磷酸二酯 键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。
(4)盖帽反应 加入乙酸酐，使极少数尚未参加缩合反应的核 苷酸单体1 中的5’—OH乙酰化，从而达到封闭的作用，终 止其以后参加缩台反应的可能性，以减少发生合成错误的机 会。
（3）连接酶连成完整双链 T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化 T4 DNA连接酶 完整的DNA双链
2. 互补延伸连接法
预先设计的片段之间有局部互补区，可以 相互作为另一个片段延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。
5’
3’
Klenow片段 引物
5’
3’
T4DNA连接酶
5’
3’
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片段。
要注意的问题:合成方向3’ → 5’ 核苷酸单体的磷酸基团在3’端 亚磷酸三酯法的磷为3价磷，需要氧化。
二、 化学合成DNA片段的组装
化学合成的DNA片段一般在200bp以内。 1. 互补连接法
（1）互补配对
预先设计合成的片段之间都有互补 区域，不同片段之间的互补区域能 形成有断点的完整双链。 （2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端 带上磷酸。（合成的DNA单链的5’端是-OH）